Микробиологический мониторинг сигар, представленных на рынке РФ
д.т.н. Моисеев И.В., к.в.н. Бовкун Г. Ф., Лёзный В.В., Симдянова Т.П., Приходько Р.П., д.м.н. Бурцева Е.А., к.т.н. Mойсеяк М.Б., Кириллов Д.Д.
В гигиенических требованиях безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов, представленных в Санитарно-эпидемиологических правилах и нормативах (СанПиН 2.3.2.1078-01) не содержатся сведения по микробиологической характеристике табачной продукции, как курительной, так и некурительной. Так же какие-либо требования к микробиологии табачных изделий отсутствуют в Техническом Регламенте ТС на табачную продукцию [ 1 ].
Тем не менее, несмотря на то, что табачные изделия не относятся к группе пищевых продуктов, собственно сам способ потребления некоторых табачных продуктов, в частности сигар и сигарилл, подразумевает прямой контакт поверхности табачного изделия (реже его мундштука ) с губами и слизистой оболочкой ротовой полости курильщика, что может стать фактором микробиологической агрессии по отношению к потребителю табака.
Допустимые санитарные показатели некоторых пищевых продуктов (хлеб, сдоба, кондитерские изделия, шоколада) представлены в СанПиН 2.3.2.1078-01[ 2 ] и включают определение общего микробного числа в КОЕ/г посевом на агар для выращивания мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (МАФанМ), а так же регуляторные ограничения по содержанию дрожжей и плесени. Единица измерения (КОЕ/г) — это колонии образующие единицы ( плотность популяции микроорганизмов ) , пересчитанные на 1 грамм исходного материала. В чае, кофе, какао определяют микробное число плесеней посевом на среды для выращивания грибов и плесеней (табл. 1).
Таблица 1. Санитарные показатели продуктов по СанПиН 2.3.2.1078-01
По данным [3] содержание в листьях табака белка, углеводов, разных аминокислот обусловливает возможность пролиферации патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В работе [ 4 ] авторами были опубликованы результаты микробиологического мониторинга трубочных табаков в режиме хранения, в рамках которого было выявлено, что исследуемые образцы табачных изделий содержат эпифитную микрофлору, представленную почвенными бациллами: Bac.subtilis (сенной палочкой), Bac. megaterium (капустной палочкой), плесневыми грибами вида Aspergillus fumigatus (аспергиллами) и грибами из рода Penicillium (пенициллиумами) в незначительных количествах ( КОЕ/г).
Целью настоящей работы являлось:
▪ изучение структуры и количественных показателей сапрофитной и патогенной микрофлоры в образцах сигар импортного и отечественного производства, а так же образцах некурительных табачных изделий — насвая и сосательного никотиносодержащего изделия фабричного производства под брендом Oden’s, так же представленного на российском рынке;
▪ изучение микробиологической этиологии сигар в режимах неправильного хранения в условиях избыточных влажности и температуры .
Объекты исследования
Объектами для исследований являются 14 образцов сигар, анализируемых в рамках химического, органолептического и микробиологического мониторинга после приобретения в специализированной розничной сети г. Москва, а так же 5 образцов сигар — в условиях моделирования неправильного хранения (температура – 350С, влажность – 100%). Моделирование условий хранения сигар при избыточных влажности и температуры проводилось в бактериологической лаборатории Брянской Государственной Сельскохозяйственной Академии( БГСХА).
Кроме того, в качестве индикатива потенциальных проблем микробиологической агрессии для табачной продукции абсолютно кустарного производства был взят образец Насвая, который производится в РФ нелегально в кустарных условиях с полным отсутствием производственной гигиены. Насвай для исследования был приобретён на оптовом рынке “Фуд-Сити” в г. Москва. Так же, микробиологические исследования проводились с образцом сосательного никотиносодержащего изделия фабричного производства под брендом Oden’s, приобретённого в специализированной табачной розничной точке в Москве.
Характеристики исследуемых сигар приведены в таблице 2 и были получены в лаборатории АО” Погарская сигаретно-сигарная фабрика” (Cвидетельство № 650 от 30.03. 2018 ФБУ “Государственный региональный центр Стандартизации, Метрологии и Испытаний Брянской области “ ).
Таблица 2. Характеристики исследуемых сигар.
*Примечание – единой и универсальной методики оценки сигар в категориях соотношения цена/качество в настоящее время не существует. В табл. 2 приводится экспертная оценка, сформированная как среднее значение дегустационной комиссии АО” ПССФ”, состоящей из 9 дегустаторов. При формировании оценки учитывалось соотношение вкусо-ароматического профиля дыма сигары относительно её розничной цены.
Химические исследования сосательного никотиносодержащего изделия фабричного производства под брендом Oden’s и образца Насвая не проводились
Методы исследования.
Все объекты исследования в момент приобретения были индивидуально упакованы в стерильные мягкие пластиковые контейнеры и перемещены в химическую, а так же микробиологическую лаборатории. Необходимо отметить, что на момент приобретения сигар, визуальных признаков наличия порчи продукции микроорганизмами на сигарах и их упаковке обнаружено не было, во всех местах продаж сигары приобретались из стационарных хьюмидоров и хьюмидорных комнат.
Исследования по определению уровня микробной контаминации сигар проводилось в бактериологическом боксе микробиологической лаборатории БГСХА. Бокс предварительно был обработан дезинфицирующим средством (“Хлорамином” в концентрации 0,5-3,0%) и ультрафиолетовыми лучами (длина волны от 260 нм). Для посевов использовались стерильные питательные среды. Используемая посуда и инструменты (перчатки, пинцеты, пипетки, чашки Петри, фарфоровые ступки, пестики, пробирки и т.д.) были предварительно простерилизованы.
Навеску 1 г каждого образца погружали в 10 мл стерильного физраствора, встряхивали 15 мин, пользуясь орбитальным шейкером, полученные экстракты в разведении 1:10 сеяли в объеме 1 мл и 0,1 мл, руководствуясь соответствующими ГОСТ или МУК по выявлению и определению количество микроорганизмов КОЕ/г или же исключению присутствия микроорганизмов.
Для выявления гнилостных бацилл использовали ГОСТ 10444-94 [5]. Экстракты в объеме 1 мл сеяли на кровяной агар (с добавлением цитрированной крови барана) и на агар МАФАнМ (для определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов в 1г образца). На кровяной агар сеяли в объёме 1 мл и 0,1мл экстракта каждого образца.
Кишечную палочку исключали по ГОСТ 30726-2001 [6] посевом экстрактов на агар Эндо в объеме 1 мл и 0,1 мл.
Сальмонеллы исключали, пользуясь ГОСТ 30519-97 [7], посевом на накопительную селенитовую среду с последующим пересевом на агар Эндо, потом на среду Клигера.
Для выделения стафилококков по ГОСТ 10444.2-94 [8] посевы делали на среду Байрд- Паркера и на кровяной агар в объеме 1мл и о,1мл.
Патогенные антракоиды исключали посевом 1мл и 0,1 мл экстрактов на кровяной агар, идентифицировали выросшие колонии по морфологическим и культуральным свойствам.
Присутствие листерий исключали согласно МУК 4.2.1122-02 [9]. Экстракты в объеме 1 мл сеяли на сывороточно-глюкозно-теллуритовый агар и полужидкий элективный агар для определения подвижности листерий.
Энтерококки выявляли руководствуясь ГОСТ 28566-90 [10]. Для посева на сывороточно-теллуритовый агар и на элективный агар для энтерококков использовали экстракты в объеме 1 мл.
Грибы выделяли по ГОСТ 10444.12-88 [11] посевом 1 мл и 0,1 мл экстрактов на среду Чапека и агар с дихлораном, бенгальским розовым и хлорамфениколом (DRBC Agar).
Исключали наличие иерсиний в образцах по ГОСТ ISO 10273-2013
” Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения условно-патогенной бактерии Yersinia enterocolitica ” посевом экстрактов в объеме 1 мл и 0,1 мл на селективный для иерсиний агар.
Посевы культивировали и учитывали результаты согласно технических документов (ГОСТов и МУК).
Для установления роли микрофлоры в 5 образцах сигар в условиях моделирования режимов неправильного хранения проводили бактериологическое и микологическое исследование экстрактов, а так же 50 мг табака каждого образца.
Выросшие колонии подсчитывали визуально и использовали счетчик для подсчета колоний. Посевы с выделенной микрофлорой фотографировали.
Результаты микробиологических исследований табачных изделий
C точки зрения микробиологического воздействия на человека важнейшими свойствами микробов являются:
— патогенность, т.е. способность микробов вызывать инфекционную болезнь различной тяжести и
— вирулентность, т.е. сумма агрессивных свойств микробов по отношению к организму человека. Вирулентность – это степень патогенности определённого штамма микробов. Мерой вирулентности служит наименьшее количество живых микробов, способных вызывать заболевание и гибель восприимчивого организма.
По своей вирулентности бактерии можно разделить на три группы:
1. патогенные (заразные);
2. условно патогенные;
3. сапрофиты.
Патогенные микроорганизмы, безусловно, опасны для здоровья человека и встреча с ними чревата инфекционными заболеваниями, особенно в случае отсутствия специфической защиты.
Условно патогенные микроорганизмы постоянно обитают внутри человеческого организма, в общем случае, не причиняя ему вреда в условиях ненарушенного иммунитета. Патогенное действие условно патогенных микроорганизмов проявляется только при изменении условий обитания и, как правило, при снижении защитных сил организма из-за различных факторов, в первую очередь тех, которые способны менять концентрацию микробов и соответственно вирулентность . В этих случаях микроорганизмы способны максимизировать свои патогенные свойства и стать источником соответствующих заболеваний.
Сапрофиты — относительно безвредные микроорганизмы. Их роль сводится к окислению и разложению мертвых органических остатков в почве, сточных водах и т. п., превращая их в неорганические и простейшие органические соединения. Сапрофиты не опасны для человеческого организма и даже в ряде случаев ограничивают развитие некоторых патогенных микроорганизмов и дрожжевых грибов за счёт своих кислых сред. Тем не менее, при снижении естественной резистентности человеческого макроорганизма возможно возникновение инфекций, вызываемых даже облигатными представителями нормальной микрофлоры — бактероидами, лактобактериями (молочнокислые) и др. Можно полагать, что представители нормальной микрофлоры являются переходными формами в эволюции сапрофитов в паразиты.
Результаты бактериологических исследований с целью определения микробного числа и выявления 8 групп микроорганизмов представлены соответственно в таблицах 3, 4, 5, 6.
Таблица 3. Рост микроорганизмов на средах, концентрация КОЕ/г при посеве 1 мл экстракта смыва 1:10 табачных изделий
Примечание: МАФАнМ – агар для выращивания мезофильных, аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов;
СТА-сывороточно-теллуритовый агар для выращивания энтерококков*; Энт/Агар- энтерококковый агар для выращивания и дифференциации энтерококков;
СТГА- сывороточно-телуритовый, глюкозный агар;
П/Ж- полужидкий элективный агар для выращивания и определения подвижности листерий;
Агар Эндо- для выращивания и дифференцирования эшерихий и сальмонелл.
*Энтерококки, ранее относимые к стрептококкам группы D, на основании строения ДНК выделены в особый род. Соответственно, изменены и их названия. Так, Streptococcus faecium теперь называется Enterococcus faecium
Общее микробное число исследуемых сигар ( табл. 3) составило от 1200 КОЕ/г до 80 КОЕ/г и представлено гнилостными бациллами, обладающими подвижностью и формирующие колонии с роением. Максимальной величиной микробного числа для анализируемых сигар характеризуются соответственно Euforia Dominican Luxury Cigars( производство и сырьё – Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество — 5 ) и Oliva G (производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 5 ). Необходимо отметить, что общее микробное число исследуемых сигар позволяет сделать вывод о том, что исследуемые сигары соответствуют санитарным показателям пищевых продуктов по СанПиН 2.3.2.10787-1 удовлетворительного уровня.
Ни один из 14 образцов сигар не содержал патогенную кишечную микрофлору, представленную сальмонеллами и листериями. Однако, в двух образцах Carlos Torano Exodus 1959 ( производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 8) и Oliva G ( производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 5) были обнаружены энтерококки вида Streptococcus faecium ( Enterococcus faecium) (рис.4 ), который обычно присутствуют в фекалиях. Оба вида данных сигар импортированы из Республики Никарагуа. Наличие данного вида микроорганизмов на сигарах вероятнее всего свидетельствует о неудовлетворительном уровне санитарии при производстве данных сигар, хотя при этом нельзя исключать такие возможные особенности региональной агротехники как использование фекалий животных в качестве удобрений (с последующим попаданием микроорганизмов на табачное сырье ), а так же использование при выращивании табака, его послеуборочной обработке и изготовлении сигар воды без соответствующей специальной бактерицидной подготовки.
В медицинской микробиологии Enterococcus faecium является условно-патогенной бактерией. Имеются данные, что данный вид микроорганизмов применяется в пищевой промышленности при изготовлении сыра и молочных продуктов, где используется способность Enterococcus faecium гидролизовать лактозу, а также эффективно подавлять болезнетворные бактерии. Для этой цели используют селекционированные непатогенные штаммы.
У людей данный вид микроорганизмов входит в состав микрофлоры ротовой полости, кишечника, мочеполовой системы. Но, с другой стороны, при снижении резистентности макроорганизма эта бактерия может быть причиной различных заболеваний, в частности, инфекции мочевыводящих путей, инфекции органов малого таза, бактериального эндокардита. В литературе описаны случаи развития спонтанного бактериального перитонита. Энтерококки, в том числе Enterococcus faecium, всё чаще становятся причиной внутрибольничных инфекций [12,13 ].
В последние годы энтерококки являются одним из наиболее распространенных участников развития анаэробно-аэробных микст-инфекций. Они способны эффективно стимулировать рост облигатно-анаэробных патогенов, усиливая их вирулентный потенциал в силу своей способности синтезировать вещества (так называемые факторы вирулентности), способствующие развитию инфекционного процесса. К таким факторам относятся поверхностные белки (цитолизины, сериновая протеинанза, желотиназа) принимающие участие в процессе адгезии и инвазии, повреждающие ткани хозяина и обеспечивающие устойчивость к антибактериальной терапии. Таким образом, энтерококки, являясь условно-патогенной флорой, при снижении защитных сил организма способны взывать аутоинфекцию, а при накоплении в окружающей среде — приводить к экзогенному инфицированию.
Рис. 1. Колонии Streptococcus faecalis на энтерококковом агаре
Рис.2. Черные колонии Streptococcus faecalis
Рис.3. Streptococcus faecalis, окраска по Граму faecalis на сывороточно- теллуритовом агаре
Рис. 4. Колонии Streptoccocus faecium на энтерококковом агаре
Эшерихии (кишечную палочку — рис.5, 6) в диапозоне от 200 до 800 КОЕ/г содержали 4 образца сигар — Oliva G (производство и сырьё — Никарагуа, cоотношение цена\качество — 5), Imperior Blend B 31( производство и сырьё — Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество – 9 ), Hidalgо (производство -Россия, сырьё вероятно – Никарагуа, cоотношение цена\качество – 4), Pelo De Oro lagarto (производство — Россия, сырьё вероятно — Никарагуа, cоотношение цена\качество – 8 ). В образце Pelo De Oro Lagarto так же содержались атипичные эшерихии с пониженной ферментативной активностью. Наличие эшерихий, как и энтерококков свидетельствовует вероятнее всего о фекальном загрязнении либо табачного сырья, либо же сигар, как уже готового продукта и , соответственно, вероятнее всего свидетельствует о неудовлетворительном санитарном состоянии производства.
Эшерихиозы (от лат. Escherichia) — название группы кишечных инфекций, вызываемых кишечной палочкой E.coli и, реже, другими сероварами кишечной палочки. Патогенные свойства связаны со способностью E. coli выделять токсины и проникать в клетки слизистой оболочки кишечника. В медицинской микробиологии различают энтеропатогенную, энтеротоксигенную, энтероинвазивную, энтерогеморрагическую, энтероадгезивную инфекцию и другие инфекции. Эшерихиоз, вызываемый энтеротоксигенными штаммами — это острая кишечная диарейная инфекция холероподобного течения, протекающая с поражением тонкой кишки без выраженного синдрома интоксикации. Заболевание является основной нозологической формой, так называемой диареи путешественников [14] .
Рис.5. Колонии кишечной палочки
Рис.6. Кишечная палочка, окраска по Граму на агаре Эндо
В образце Насвая выделена Ps aeruginosa (синегнойная палочка, рис.7-9), которая характеризовалась сплошным ростом с зеленым пигментом. Ps aeruginosa – один из основных возбудителей гнойно-воспалительных процессов, в особенности, в условиях стационара. Данный микроорганизм относится к условно- патогенным для человека. Обитает в воде, почве, на кожных покровах человека. Существенное значение для циркуляции возбудителя во внешней среде имеет вода, в которой при температуре 37 градусов возбудитель может выживать до 1 года, очень устойчив во внешней среде. Данное обстоятельство имеет важное значение для соблюдения правил хранения и транспортировки табачных изделий.
Патогенное действие обусловлено образованием экзотоксинов и высвобождением эндотоксинов при гибели клеток. Вырабатывает следующие экзотоксины: экзотоксин А — вызывает нарушение организации матрицы белкового синтеза, экзоэнзим S — вызывает глубокие патологические процессы в лёгких, цитотоксин — вызывает нейтропению и цитолиз других клеток, гемолизины, фосфолипазы. Среди продуктов жизнедеятельности значение имеют энтеротоксический фактор (возможно ответственный за развитие диарейного синдрома), фактор проницаемости, нейраминидаза (нарушает метаболизм нейраминовой кислоты), протеолитические ферменты (протеазы, коллагеназа). Эти соединения способствуют формированию плохо контролируемого воспаления и массивному повреждению тканей с выраженными деструктивными измене-ниями. Характерной особенностью синегнойной палочки является ее нечувствительность ко многим антибактериальным препаратам, что с клинической точки зрения существенно затрудняет лечение очага инфекции и нередко при-водит к септицемии с развитием летального исхода.
Другая микрофлора помимо Psaeruginosa не была обнаружена в образце Насвая , что собственно можно объяснить антагонистическим действием и высокой микробиологической активностью собственно самой синегнойной палочки.
Рис. 7. Колонии синегнойной палочки на кровяном агаре
Рис. 8. Чистая агаровая культура синегнойной палочкa
Рис.9. Синегнойная палочка, окраска по Граму
Образец Oden, s представлял собой сыпучую смесь волокон и химических веществ и не содержал микрофлору при посеве на используемых средах.
Для получения четких результатов роста дальнейшие исследования проводили бактериологическое исследование, используя разведение 0,1 мл смывов табачных изделий.
С целью выделения антракоидов, патогенных стафилококков, стрепто-кокков, иерсиний проводилось бактериологическое исследование посевом 0,1 мл смывов образцов в разведении 1:10 на кровяной агар, иерсинияагар. В этих образцах выделяли грибы посевом 1 мл смыва на агар Чапека и агар DRBC; результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4. Содержание микроорганизмов в табачных изделиях, КОЕ/г
К антракоидам (сибиреязвенноподобным) относят гнилостные бациллы в том числе, такие как Bac. subtilis – сенная палочка, Bac. megaterium – капустная палочку, Bac. mesentericus – картофельная палочка, Bac. mycoides – кор-невидная бацилла, Bac. cereus.
Сенна́я па́лочка (Bacillus subtilis)- хемоорганогетеротроф, аммонифицирует белки, расщепляет крахмал, гликоген, является продуцентом протеаз, амилаз, аминокислот и некоторых полисахаридов. Развивается при темпера-туре +5…+45 °С. Согласно санитарно-эпидемиологическому правилу СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (приложение № 1) не относится к патогенным для человека микроорганизмам [15]. Bac. mesentericus – картофельная палочка – патогенна для человека при нарушениях целостности кожи и слизистой , при попадании в органы и полости вызывает гнойно-воспалительные процессы. Как правило, обнаруживается вместе с сенной палочкой и её выделяют при обследовании больных с кишечной инфекцией .
Bac. megaterium – капустная палочка. Обычно выделяется из клинического материала вместе с Bac. cereus. По данным О.К. Поздеева [12] антракоиды можно считать условно патогенными, которые вызывают у чело-века госпитальные поражения ( пневмонии, септицемии, эндокардиты, менингиты, сепсис). Cогласно [12] чаще всего госпитальные инфекции вызывает Bac. Cereus–почвенная бактерия сапрофит, широко распространенная в природе. Bac. cereus является значимым индикаторным тест-организмом для пищевой промышленности. Пищевые продукты, подверженные наиболее часто-му риску заражения- это мясные и молочные продукты, овощи, супы и спе-ции. Почти все штаммы B. Cereus продуцируют токсины (негемолитический энтеротоксин и гемолизин BL). Некоторые из штаммов также продуцируют термостабильный рвотный энтеротоксин. Данные виды энтеротоксинов образуются в кишечнике после употребления продуктов, загрязненных вегетативными клетками или спорами b. Cereus. Размножению данного микроорганизма препятствует кислая среда и высокая концентрация сахара, при хранении зараженной пищи в холодильнике-патоген не размножается.
Bac. cereus способен вызывать два типа пищевых отравлений (гастроэнтеритов):
— Отравления первого типа отличает укороченный инкубационный период (около 4-5 часов), характерны изнуряющие диарея и рвота;
— Отравления второго типа отличает более продолжительный инкубационный период (около 17 часов) с диареей и болевым синдромом, похожие на клинику гастроэнтеритов, вызванных клостридиями.
Перечисленные микроорганизмы образуют колонии с роением, вокруг которых образуется гемолиз при посеве на кровяной агар. Из них гемолитическая активность не установлена только у капустной палочки. Перечисленные микроорганизмы отличают от возбудителя сибирской язвы по cледующим признакам: подвижность, отсутствие капсул, наличие гемолиза, устойчивость к пенициллину, отсутствие патогенности для белых мышей.
Рис. 10. Колонии Bac.cereus на кровяном агаре
В микробиологии аэробных спорообразующих сибиреязвенноподобных микроорганизмов таких как Bac. subtilis – сенную палочку, Bac. megateri-um – капустную палочку, Bac. mycoides – корневидную бациллу, Bac. cereus, которая вызывает гибель белых мышей при внутрибрюшинном заражении, считают сапрофитами [16].
В смывах табачных изделий Aristocrat (производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 7 ) гнилостные бациллы (антракоиды) не содержались. Из остальных образцов были выделены как гемолитически активные антракоиды, так и сапрофитные гнилостные бациллы, не разрушающие эритроциты:
▪ Подвижные колонии гнилостных бацилл-сапрофитов без гемолиза обнаружили в 5 образцах сигар, соответственно : Euforia Dominican Luxury ( производство и сырьё – Домениканская Республика, cоотношение цена\качество — 5 ) , Perdomo Habano Corojo (производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 3 ), Oliva G (производство и сырьё — Ника-рагуа, cоотношение цена\качество — 5) в количестве по 200 КОЕ/г, Imperior Blend B 31( производство и сырьё — Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество 9 ) – по 500 КОЕ/г, Te-Amo Nicaragua Blend ( производство – Мексика, сырьё – Мексика и Никарагуа, cоотношение цена\качество 4 ) – по 100 КОЕ/г.
▪ Сенную палочку ( рис. 11, 12) с гемолитической активностью была обнаружена в количестве 200 КОЕ/г в образцах LFD Double Ligero ( производство и сырьё – Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество — 6) , Carlos Torano Exodus 1959 (производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 8), в количестве 100 КОЕ/г – в сигарах Plasencia Reserva 1898 ( производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 3);
▪ Корневидная бацилла ( рис. 13 ) с гемолитической активностью в количестве 300 КОЕ/г содержалась в Cumpay Robusto ( производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 7) и в количестве 400 КОЕ/г в La Aurora Connecticut ( производство и сырьё – Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество — 8) .
▪ Капустную палочку ( рис. 15, 16) содержали Davidoff Geneve Robusto Escurio ( производство и сырьё – Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество — 6) в количестве 600 КОЕ/г , в количестве 500 КОЕ/г Pelo De Oro Lagarto (производство -Россия, сырьё вероятно — Никарагуа, cоотноше-ние цена\качество – 8).
Необходимо отметить, что общее число аэробных спорообразующих сибиреязвенноподобных микроорганизмов в исследуемых сигарах позволяет нам сделать вывод, что исследуемые сигары соответствуют санитарным показателям пищевых продуктов по СанПиН 2.3.2.10787-01 удовлетворительного уровня.
Рис. 11.Колонии Bac. subtilis на кровяном агаре
Рис.12. Bac. Subtilis, окраска по Граму
Рис.13. Колонии Bac. Мycoides на кровяном агаре
Рис.14. Колонии картофельной палочки на МАФАнМ- агаре
Рис. 15. Капустная палочка, окраска по Граму
Рис. 16 Колонии капустной палочки на МАФАнМ агаре
▪ Синегнойная палочка ( рис.7-9) контаминировала образец Насвая в количестве 200 КОЕ/г. Синегнойная палочка имеет широкий спектр патологии у человека. Она возбудитель внутрибольничных инфекций, протекающих септически, тяжелых отравлений (гастроэнтеритов), нагноения ран.
Сапрофитные стафилококки ( рис. 17, 18) – обитатели кожи без гемолитической и коагулазной активности были обнаружены в образцах сигар Aristocrat (производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 7 ) – 700 КОЕ/г, Pelo De Oro lagarto (производство -Россия, сырьё вероятно — Никарагуа, cоотношение цена\качество – 8) в количестве 200 КОЕ/г.
Посевом на кровяной агар были обнаружены сапрофитные стрептококки – обитатели кожного покрова в образцах Carlos Torano Exodus 1959 (производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество – 8) — 100 КОЕ/г, Oliva G (производство и сырьё — Никарагуа, cоотношение цена\качество — 5) – 500КОЕ/г, Te-Amo Nicaragua Blend ( производство – Мексика, сырьё – Мексика и Никарагуа, cоотношение цена\качество 4 ) -200 КОЕ/г.
На кровяном агаре высевались и энтерококки вида Str.faecalis — представители факультативной микрофлоры кишечника человека, животных, про-лиферация которых обусловливает колонизацию кишечника и формирует функциональный дисбактериоз кишечника. Высокую плотность энтерококков показал образец Насвая — 1200 КОЕ/г.
Высокая плотность энтерококков в образце Насвая позволяет нам сделать вывод о неудовлетворительном санитарном состоянии данного продукта согласно показателей пищевых продуктов по СанПиН 2.3.2.10787-1
Рис.17. Колонии Staphylococcus saprophyticus на иерсиния агаре
Рис.18. Stafhylococcus saprophyticus, окраска по Граму
Патогенные иерсинии не были выделены при посеве, при этом на иерсиния агаре были идентифицированы сапрофитные стафилококки, сарцины-сапрофиты обитатели почвы. Для сигар Davidoff Geneve Robusto Escurio (производство и сырьё – Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество – 6) обнаружена концентрация 600 КОЕ/г. Cапрофитные стафилококки, сарцины-сапрофиты всегда присутствуют в воздухе вместе с энтерококками и их количество соответствовало посеву на кровяной агар.
Для выделения грибов 1 мл смыва сеяли на агар Чапека и агар DRBC, полученные результаты были идентичными. Споры грибов аспергилл и дрожжей ( рис. 19- 20) содержались в 5 образцах : LFD Double Ligero Ligero ( производство и сырьё – Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество — 6) — 200 КОЕ/г, Imperior Blend B 31( производство и сырьё — Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество 9 ) — 100 кОЕ/г.
Аспергиллы идентифицировали как Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger ( рис. 21), Aspergillus parasiticus ( рис. 22). Образцы Cumpay Robusto ( производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 7) — 200 КОЕ/г и Aristocrat (производство и сырьё – Никарагуа, cоотношение цена\качество — 7 ) – 100 КОЕ/г содержали дрожжеподобные грибы рода Can-dida, колонии белого цвета состояли из дрожжевых клеток, не содержали гиф и хламидоспоры.
Дрожжеподобные грибы из рода Candida считают сапрофитными видами — комменсалами полости рта, желудочно-кишечного тракта, кожи, но они возбудители оппортунистических микозов у больных людей с различными нарушениями иммунобиологической резистентности. Инфекции, вызываемые кандидами, обычно развиваются как эндогенные заболевания с фунгемией и развитием микроабсцессов в органах дыхания, центральной нервной системы, сердца.
При посеве 0,1 мл смыва 1:10 табачных изделий на агар DRBC не обнаруживали роста колоний грибов, что свидетельствовало о незначительной контаминации cигар спорами грибов.
Рис. 19. Колония дрожжей
Рис. 20. Клетки дрожжей, окраска по Граму
Рис.21. Колония Aspergillus niger на агаре Чапека
Рис.22. Колонии Aspergillus parasiticus на агаре Чапека
Микробное число табачных изделий по результатам посева на МАФАнМ, спектр выделенных микроорганизмов, их количество представле-ны в таблице 5.
Таблица 5 – Микробное число, спектр микроорганизмов, количество КОЕ/г табачных изделий
Образец Oden,s не содержал вообще какую-либо микрофлору.
Образец Насвая содержал синегнойную палочку Pseudomonas aerugino-sa, имеющую широкий спектр патогенности в том числе поражающую желудочно-кишечный тракт. Этот образец имел самую высокую микробную контаминацию 1800 КОЕ/г, содержал условно патогенный Str.faecalis (1600 КОЕ/г)– показатель присутствия фекального загрязнения и сапрофитных стафилококков – обитателей кожи.
Исследуемые образцы сигар не содержали патогенную микрофлору, способную вызвать острые кишечные инфекционные заболевания, обусловленные наличием таких возбудителей как иерсинии, сальмонеллы, листерии, но во многих образцах содержались условно патогенные микроорганизмы такие как Bac.mycoides, Bac.subtilis, Str.faecalis и др.
Характеризуя общую микробную обсемененность по результатам посева на агар МАФАнМ и элективные среды, следует отметить (согласно норм СанПиН 2.3.2.10787-1) низкий уровень контаминации табачных изделий сапрофитной и условно-патогенной микрофлорой, источником которой являлась окружающая среда (почва, воздух, кожа рук изготовителя и средства произ-водства, загрязненные фекалиями).
Принимая во внимание результаты бактериологических и микологических исследований, образцы табачных изделий разделили по санитарной оценке на три группы (хорошая, удовлетворительная, неудовлетворительная).
Хорошую оценку имели образцы, обсемененные:
▪ только сапрофитной микрофлорой, источником которой была почва;
▪ условно патогенной микрофлорой при недостаточности массивности контаминации, источником которой была почва;
▪ сапрофитной микрофлорой, источником которой был фекалий.
Удовлетворительную санитарную оценку имели табачные изделия контаминированные условно патогенной микрофлорой, источником которой был фекалий, почва, при условии недостаточности массивности инфицирования.
Неудовлетворительно характеризуется Насвай. В составе микрофлоры этого образца выявлена синегнойная палочка, обусловливающая риск воз-никновения гастроэнтерита, представитель факультативной микрофлоры кишечника условно патогенного действия — Str.faecalis, сапрофитные стафилококки с высокой плотностью популяций — 1800 КОЕ/г.
Санитарная оценка табачных изделий с определением вероятного источника контаминации исследуемых сигар представлена в таблице 6
Таблица 6. Санитарная оценка табачных изделий и предполагаемые источники контаминации микрофлорой
По результатам бактериологических и микологических исследований из 16 образцов табачных изделий 13 образцов имели относительно хорошее санитарное состояние: они содержали сапрофитную микрофлору, источником которой была почва и фекалий, условно патогенную микрофлору при недостаточной контаминиции, источником которой была почва. 2 образца имели удовлетворительную микробиологическую характеристику, так как они со-держали условно патогенные микроорганизмы эшерихии, Bac.cereus, Str.faecalis, As.parasiticus.
Моделирование условий избыточных температурных и влажност-ных режимов хранения сигар. Микробиологические показатели сигар при неправильном хранении.
Рекомендованные стандартные условия хранения сигар: температура 16-180С, относительная влажность воздуха – 65-70%. Во время эксперимента моделирования условий избыточных температурных и влажностных режимов хранения сигар температура бокса составила – 350С при относительной влажности воздуха – 100%. Длительность эксперимента – 30 суток.
До начала эксперимента никаких визуальных признаков порчи не было обнаружено. По прошествии 30 суток визуальным обследованием 5 образцов сигар были обнаружены признаки порчи в виде серого налета. Результаты посева образцов и их смыва физроствором 1:10 в объеме 1 мл были идентичными при посеве на агар МАФАнм, агар Чапека и агар DRBC . Результаты данных исследований представлены в таблице 7.
Таблица 7. Вид микроорганизмов и их количество, КОЕ/г
Порча сигар была обусловлена вегетированием сенной палочки, плотность контаминирования которой составляла от 50 до 84 КОЕ/г. Образец La Аurora Connecticut ( производство и сырьё – Доминиканская Республика, cоотношение цена\качество — 8) содержал только споры сенной палочки в количестве 50 КОЕ/г, остальные cигары содержали еще и плесневые грибы. Спектр грибов и их количество по результатам микологического исследования с использованем агара Чапека и DRBC агара были идентичными. Доминировали грибы аспергиллы видов As.parasiticus, As.niger и пенициллы. Перечисленные виды грибов обитают в почве, их споры всегда присутствуют в воздухе.
Большинство грибов способно развиваться на различных питательных сре¬дах, для их питания необходимы азотистые, углеродсодержащие и минеральные вещества. Оптимальной температурой для большинства грибов является 25-37°С и только некоторые из них (аспергиллы) развиваются и при более высокой температуре (40- 45°С). Наиболее пригодны для большинства патогенных грибов слабокислые среды (pH 6,0-6,5), однако они сохраняют жизнеспособность в широком диапазоне pH (3-10). Аспергиллы являются патогенными грибами: As.niger — выступает нередко причиной отомикоза и может быть причиной аллергических состояний (продукция афлотоксина) и как вид (наряду с A. terre¬us),колонизирует открытие полости тела человека. Аспергиллы являются провокаторами заболевания аспергилёзом.
Пенициллы ( лат. Penicillium) относятся к роду плесневых грибов и по-мимо порчи органических продуктов, — могут так же вызывать аллергические заболевания , становясь причиной астмы , бронхита, онихомикозов, пенициллиоза.
Рис.23. Колонии сенной палочки и грибов на агаре
Рис.24.Колонии сенной палочки DRBC – посеве табака на DRBC – агаре
Рис.25. Колонии аспергилл на DRBC – агаре
Рис. 26.Колонии пенициллиумов на DRBC – агаре
Выводы:
- Химический состав табачного сырья, используемого при изготовлении исследуемых образцов сигар , а так же рекомендованные стационарные ( и нестационарные — т.е. отличные от рекомендованных ) условия их хранения являются достаточными факторами для поддержания жизнедеятельности потенциально агрессивной для курильщика микробиологической биоты различных видов – от сапрофитов до условно патогенных Bac.mycoides, Bac.subtilis, Str.faecalis , Escherichia (E.coli) , синегнойной палочки — Pseudomonas aeruginosa и группы патогенных грибов – аспергиллов. Полный спектр выявленной во время исследований микрофлоры представлен гнилостными бациллами, не обладающими гемолитической активностью, сапрофитными стрептококками (Str. faecium), сапрофитными стафилококками (Staphylococcus saprophyticus), эшерихиями (E.coli) с пониженной ферментативной активностью, дрожжами.
- Наличие микробиоты на образцах сигар, в количествах обнаруженных с помощью микробиологических исследований, не влияет на вкусо-ароматический профиль дыма сигар. Сигары как с высоким, так и со сравнительно низким соотношением цена\качество могут одинаково непрогнозируемо нести в себе риск наличия надпороговых значений заражённости микроорганизмами c соответствующими рисками клинической патологии.
- В целом, по результатам бактериологических и микологических исследований из 14 образцов табачных изделий фабричного производства 12 образцов имели хорошее санитарное состояние, они содержали сапрофитную микрофлору, источником которой вероятнее всего была почва и фекалий, условно патогенную микрофлору при недостаточной контаминации, источником которой была почва. 2 образца имели удовлетворительную микробиологическую характеристику, так как содержали условно патогенные микроорганизмы- эшерихии, Bac.cereus, Str.faecalis, As.parasiticus.
- Так же необходимо отметить, что вся выделенная в рамках настоящего исследования условно-патогенная микрофлора является достаточно устойчивой к крепким алкогольным напиткам на основе этилового спирта. В этой связи, обмакивание кончика сигары в виски или коньяк при курении, практикуемое некоторыми любителями сигар, вряд ли можно рассматривать как способ стерилизации .
- Образец промышленного фабричного производства Oden’s (GN Tobacco, Швеция) представлял сыпучую смесь видимо пищевых волокон и химических веществ и не содержал микрофлору при посеве на 11 сред (кровяной агар, иерсиния агар,МАФАнМ, сывороточно-теллуритовый агар, энтерококковый агар, сывороточно-теллуритовый глюкозный агар, селективный полужидкий агар для листерий, селенитовый бульон для сальмонелл, агар Эндо, агар Чапека, DRBC агар). Т.е. с точки зрения микробиологической защиты потребителя Oden’s является практически идеальным продуктом перорального потребления для доставки никотина.
При этом, анализируя химический состав сигар можно с высокой степенью вероятностью утверждать, что в представленном диапозоне изменений химического состава исследуемых образцов,- химия табачного сырья сигар не влияет на спектр присутствующей и выделенной микробиоты. Так же маловероятно, что спектр микробиоты сигар зависит от географического местоположения источника сырья.
При этом, кустарно произведенный Насвай, как продукт аналогичного способа потребления, содержит патогенный возбудитель — синегнойную палочку, обусловливающую риск возникновения гастроэнтерита, а также представителя факультативной микрофлоры кишечника условно патогенного действия — Str.faecalis с высокой плотностью контаминации 1800 КОЕ/г и сапрофитные стафилококки. В [17-19] показаны родственные связи между рядом патогенных бактерий и соответствующими обитателями почвы и воды (кислотоустойчивые микобактерии, дифтероиды, водные вибрионы).
В других образцах табачных изделий патогенные микроорганизмы (иерсинии, сальмонеллы, гемолитические стафилококки, стрептококки, листерии, токсические грибы) не были обнаружены.
Проведение моделирования влияния избыточных влажностных и температурных режимов при хранении сигар показало, что порча сигар во время неправильного хранения будет обусловлена вегетированием сенной палочки, плотность контаминирования которой в рамках эксперимента составила от 50 до 84 КОЕ/г, а так же плесневых грибов видов As.parasiticus, As.niger, представителей рода Penicillium.
5.Несмотря на отсутствие государственных санитарных регуляций табачных изделий проведенными бактериологическими и микробиологическими исследованиями выявлена потенциально агрессивная для потребителя-курильщика микрофлора во всех образцах табачной продукции. Наличие в основном условно патогенной микрофлоры , хоть и без превышения санитарных порогов соответствия (по аналогии с продукцией пищевой промышленности ) свидетельствует вероятнее всего о ряде фактов:
— об отсутствии регулярного микробиологичского мониторинга сырья на предприятиях – изготовителях сигар;
— об отсутствии регулярного микробиологического контроля продукции на предприятиях – изготовителях сигар, а следовательно и об отсутствии в технологическом цикле оборудования и реализованных технологий подавления потенциальной микробиологической агрессии как в самом процессе изготовления, так и при организации хранения , а так же логистике поставки до потребителя;
— об отсутствии какого-либо хотя бы избирательного микробиологического контроля в инфраструктуре продаж.
Все вышеперечисленные тезисы так же негативно характеризуют сегодняшнюю стратегию государства в области национального здоровья, поскольку никаких формальных требований какого-либо соответствия к микробиологической благополучности такой табачной продукции как сигары и сигариллы с натуральным покровом из листового табака в настоящее время не предъявляется ни на одной стадии её изготовления и доставки до потребителя.
Заключение
Широко известными фактами являются физико-химические методы профилактики микробиологической агрессии с помощью достижений современной химической промышленности и адаптация опыта медицинской практики.
Известно, что из неорганических веществ наиболее ядовиты для микроорганизмов соли тяжелых металлов (ртути, меди, серебра). При их концентрации 1:1000 большинство бактерий погибает в течение нескольких минут. Бактерицидное действие оказывают хлор, йод, перекись водорода, марганцовокислый калий. Из минеральных кислот этими свойствами обладают сернистая, борная и некоторые другие кислоты. Сильными ядами для микробов являются фенол (карболовая кислота), креозол, формалин. В различной степени токсичны спирты и некоторые органические кислоты (салициловая, масляная, уксусная, бензойная).
Поэтому обработка рабочих поверхностей, средств производства, соответствующая регламентная гигиена рабочих помещений и рук персонала, а так же сырья с использованием растворов необходимых концентраций существенно снижает риски контаминаций, порчи продукции и негативного воздействия на потребителя.
Известно так же, что прямой солнечный свет убивает почти все виды бактерий, за исключением пурпурных и фотобактерий. Под действием прямых солнечных лучей многие бактерии гибнут за несколько минут. Биологическое действие солнечного света на микробы обусловлено находящимися в нем ультрафиолетовыми лучами. После проникновения в клетку они, адсорбируясь жизненно важными частями, белками и нуклеиновыми кислотами, вызывают фотохимические и окислительные процессы, губительно действующие на микроорганизмы. Ультрафиолетовые лучи убивают через несколько минут и вегетативные формы и споры.
В биологическом отношении наиболее интересны ультрафиолетовые лучи с длиной волны от 280 до 230 нм. Они обладают выраженным бактериостатическим и бактерицидным действием. В зависимости от дозы облучения и вида микроорганизма действие ультрафиолетовых лучей может быть летальным или мутагенным.
Лампы, испускающие ультрафиолетовые лучи с длиной волны 254 нм, широко применяют для стерилизации посуды, дезинфекции воздуха в больницах и операционных, в школах, в борьбе с долгоносиком, поражающим зерно. Ультрафиолетовые лучи используются и для стерилизации воды, молока, материалов, разрушающихся при действии высоких температур. Так же успешно ультрафиолет используется для обработки готовых табачных изделий ручного производства перед упаковкой, в частности , на Погарской сигаретно-сигарной фабрике, фабриках Республики Куба и фабриках машинных сигар ЕС. Использование методов защиты от контаминации считается необходимым аспектом качества сигар и ответственным отношением производителя к своему потребителю.
Литература:
- «Технический регламент на табачную продукцию» (ТР ТС 035/2014). Решение Совета ЕЭК от 12 ноября 2014 года N 107, вступил в силу с 15 мая 2016 года.
- СанПиН 2.3.2.10787-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов»
- Физико-химические аспекты технологического процесса тестирования берлея/ И.В. Моисеев, Н.В. Пуздрова, Д. Г. Кротов// Товассо Ревю. 2006. №2. С. 36-55.
- Микробиологический мониторинг трубочных смесей ПССФ, изготовленных на основе табачного сырья различных типов послеуборочной обработки, в условиях изменений режимов хранения/ Моисеев И.В., Бовкун Г. Ф., Лёзный В.В., Симдянова Т.П., Приходько Р.П., Бурцева Е.А., Mойсеяк М.Б.// Товассо Ревю. 2018 . №4 . С 24-30. .
5. ГОСТ 10444-94 « Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов»
6. ГОСТ 30726-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli»
7. ГОСТ 30519-97 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella»
8. ГОСТ 10444.2-94 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения Staphylococcus aureus»
9. МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocitogenes в пищевых продуктах».
10. ГОСТ 28566-90 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества энтерококков».
11. ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Методы определения дрожжей и плесневых грибов».
12. Медицинская микробиология/ О.К. Поздеев// 3-е изд. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2005.-768с.
13. http://www.gastroscan.ru/handbook/117/1782
14. Этиология и патогенез — Эшерихиозы — Э — Медицинская энциклопедия — Medkurs.ru — медицинский сервер.
15. Санитарно-эпидемиологические правила СанПиН 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней, ИПС «КонсультантПлюс» (некоммерческая интернет версия).
16. Колычев Н.М. Ветеринарная микробиология и иммунология. Учебник для вузов// Н.М. Колычев, Р.Г. Гозманов// М.: Колос С. 2003. С.247-255.
17. Петровская В. Г. и Марко О. П. Микрофлора человека в норме и патологии, М., 1976;
18. Стейниeр Р., Эдельбeрг Э. и Ингрэм Дж. Мир микробов, пер. с англ., т. 1 — 3, М., 1979;
19. Чахава О. В., Горская E. М. и Рубан С. 3. Микробиологические и иммунологические основы гнотобиологии, М., 1982.