Дифференцированный анализ изменений в структурах углеводного и кислотного комплексов табачного сырья при изготовлении трубочного табак

Моисеев И.В., д.т.н., профессор, Мойсеяк М.Б., к.т.н., доцент, Лезный В.В., Приходько Р.П., Симдянова Т.П., Подкопаев Д.О., к.т.н., Коржнев Е.Н., к.т.н.

В работе [2] нами было показано, что при изготовлении Кавендиша происходят изменения в углеводно-белковом комплексе табака, а так же наблюдается смещение рН в кислую среду. Данные изменения происходят с различной степенью эффективности как для, собственно, табаков различных ботанических сортотипов, так и для одного сортотипа, подвергнутого различным видам( или температурно-влажностным условиям) в рамках одного типа сушки в процессе первичной послеуборочной обработки табачного сырья. В настоящей работе объектом исследования является табачный бленд на основе Вирджинии- FCV и Берлея. Химические параметры исходного сырья, соусированного перед технологической обработкой табака и полученного Кавендиша приведены в таблице 1,

- экспериментальные данные получены в лаборатории ОАО’’ Погарская сигаретно-сигарная фабрика’’(Свидетельство № 360, выдано 26.09.12 г. ФБУ «Гос. региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в Брянской обл.»).


Таблица 1. Химические показатели бленда трубочного табака Кавендиш на разных этапах производства


Пиро-
лизат,
мг/г

Нико-
тин,
%

Угле-
воды
%

Саха
ра
%

Белки
%

Хлор
%

Калий
%

рН

Угле-
воды/
белки

Сахар/
Никотин

Калий/
хлор

1

Иcходный
бленд

143

2,40

16,50

9,68

10,25

0,58

3,67

5,61

1,61

4,03

6,32

2

Соусиро-
ванный
бленд

148

2,68

15,50

11,58

8,75

0,51

3,08

5,20

1,77

4,32

6,04

3

Кавендиш

162

1,96

11,42

10,29

10,81

0,36

3,24

4,12

1,06

5,25

9,00

4

Изменение
параметра, %

13

18,2

30,8

6,5

6

37,9

11,7

26,4

34,16

30,5

42,5


Таким образом исходя из результатов таблицы 1 можно отметить, что исследуемый бленд FCV-Вирджинии и Берлея характеризуется следующими основными изменениями в процессе изготовления Кавендиша:

- пиролизат увеличивается на 13%, что обусловлено, видимо, появлением в ходе реакции Майяра и сопровождающих ее реакций высокоатомных соединений, - летучих при высокой температуре и легко конденсирующихся при первой возможности;

-аналогично другим нашим исследованиям[2] наблюдается снижение количества никотина на 18% и уменьшение углеводов, что характеризует реакцию взаимодействия соединений аминной и карбоксильной групп;

- рН смещается в кислую среду более, чем на 20%, что характеризует, видимо, процессы генерации дополнительного количества органических кислот в ходе технологического процесса;

- наблюдается существенное улучшение параметров горючести (соотношении калий\хлор) за счет 3-х- кратного снижения содержания хлоридов по сравнению с солями калия.

В ходе проделанной исследовательской работы были проанализированы образцы табака c целью определения содержания органических кислот и сахаров, соответственно, до и после окончания процесса горячей суперферментации. Анализ органических кислот был проведен методом ионообменной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией [4]. Для проведения исследований использовался хроматограф Dionex ics 2100.

Анализ на содержание сахаров был выполнен двумя методами: качественное определение сахаров, присутствующих в образцах табака до и после ферментации, а так же исходного соусированного бленда, - методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) [3] с последующей экстракцией областей содержащих вещества и снятием их ИК-спектров; количественное определение глюкозы, фруктозы, сахарозы в образцах табака и соуса осуществлялось методом ферментативного анализа. Для количественного определения сахаров использовался автоматический биохимический анализатор Кonelab arena 20xt, для ИК-спектроскопии [5] был использован ИК-спектроскоп Spektrum 100( Perkin Elmer).

Анализу предшествовало сличительное измерение pH полученных образцов табаков в лаборатории МГУПП. В таблице 2 представлены данные по рН табака до и после ферментации.

Таблица 2. Водородный показатель pH образцов табака.

Образец

Шифр

pH

Табак кавендиш до ферментации

К1

5.4

Табак кавендиш после ферментации

К2

4.3


Данные таблиц 1 и 2 демонстрируют хорошее совпадение результатов по водородному показателю и показывают, что после ферментации произошло смещение показателя pH в сторону кислой среды, что ,вероятнее всего, является следствием образования в Кавендише органических кислот. Данная тенденция подтверждается работой [6], где так же было выявлено изменение процентного содержания сахаров и органических кислот в ходе похожих технологических процессов (Ageing), сопровождающихся улучшением и смягчением вкуса табака.

В результате исследования качественного состава сахаров методом ТСХ во всех образцах табака были обнаружены только глюкоза и фруктоза. Для разделения сахаров в рамках данной методики использовались готовые к использованию ТСХ- пластинки марки ‘’Silufol’’(производство Чешская республика). В качестве подвижной фазы использовалась смесь растворителей: ацетон - этиловый спирт - ледяная уксусная кислота ( в соотношении 3-1-1 по объему). Разделение происходило в течение 10-15 минут при комнатной температуре. Проявление пластин осуществлялось опрыскиванием их 5%-ым раствором фосфорномолибденовой кислоты в изопропаноле и последующей сушкой при 110 0С. Одновременно проводилось ТС -хроматографирование без проявления с последующим снятием слоя сорбента и его промывкой спиртом. Спиртовой экстракт наносился на ZnSe стекла ИК-кювет, высушивался, и затем проводилась ИК-спектроскопия.

На рисунке 1 представлена ТСХ- пластина с разделенными глюкозой, фруктозой и сахарозой после проявки фосфорномолибденовой кислотой.

Рисунок 1. Разделение глюкозы, фруктозы и сахарозы методом ТСХ.

Коэффициенты Rf составили: 0.5; 0.61; 0.44 для глюкозы, фруктозы и сахарозы соответственно.

Примечание: Rf - это качественная характеристика веществ в ТСХ, Rf = Lsub/Lsol, где Lsub – расстояние пройденное веществом от точки старта, Lsol – расстояние, пройденное растворителем от точки старта. Мы использовали эту величину для определения местонахождение исследуемых веществ, не прибегая к технологии их проявления , чтобы отделить их методом скрабирования без проявителя и переместить для дальнейшего анализа на ИК-спектроскопию.

На рис. 1 представлена проявленная пластинка, с разделенными глюкозой, фруктозой и сахарозой с целью нахождения коэффициентов Rf.

На рис. 2 представлена ТСХ- пластина с разделенными образцами табаков и сиропа после проявки фосфорномолибденовой кислотой.


1- Табак до ферментации,

2 - Кавендиш после ферментации,

3- Глюкозо-фруктозный сироп (соус)

Комментируя рис. 1,2 необходимо отметить, что процент совпадения характеризует главным образом чистоту и условия съемки исследуемых веществ. Из рис. 1 (ТСХ отдельных сахаров) видно, что помимо четких фокусированных пятен отдельных сахаров, рядом с ними наблюдается еще небольшой шлейф. Это свидетельствует о том, что для используемой методики разделения смеси сахаров невозможно их 100%- разделение, поскольку всегда в растворе (твердой фракции) остаются примеси. Именно эти примеси и снижают уровень сходства эталонных спектров, снятым для очень чистого вещества в идеальных условиях. Графическую визуализацию этого процесса мы наблюдаем на спектрограммах рис. 3-8, где представлены ИК-спектры глюкозы и фруктозы для эталонных(слева) и анализируемых(справа) соединений. Эталонные спектры отличаются от исследуемых меньшими количеством и амплидудой флуктуаций линии спектрограммы.

Необходимо дополнительно отметить, что чем меньше концентрация исследуемого вещества в пробах, тем меньше по площади становятся пятна на ТСХ-пластинах, причем при этом снижаются эффекты размывания пятен и их наложения друг на друга. Это явление наглядно отражено на рис. 2 (ТСХ образцов табака и соуса). Концентрация сахаров в табаке мала по сравнению с насыщенным раствором, поэтому пятна, характеризующие наличие (и концентрацию) сахаров получаются также маленькие и не перекрывают друг друга. Противоположную картину мы можем наблюдать в соусе, где, несмотря на то, что концентрация пробы была уменьшена в 10 раз, - количество сахаров все равно оказалось избыточным и именно поэтому отдельные фрагменты пятен сливаются в единое целое большого размера удлиненной формы.

На рисунках 3-8 представлены ИК-спектры глюкозы и фруктозы для эталонных (слева) и анализируемых (справа) соединений.

Рисунок 3. ИК-спектр глюкозы в образце соусированного табака

(Совпадение - 87,8% с эталонным спектром D (+)-Glucose).

Рисунок 4. ИК-спектр фруктозы в образце соусированного табака( Совпадение - 86,9% с эталонным спектром D (-)-Fructose).

Рисунок 5. ИК-спектр глюкозы в образце табака до ферментации (Совпадение на 89,7% с эталонным спектром D (+)-Glucose).

Рисунок 6. ИК-спектр фруктозы в образце табака до ферментации (Совпадение - 93,1% с эталонным спектром D (-)-Fructose).

Рисунок 7. ИК-спектр глюкозы в образце Кавендиша после ферментации (Совпадение - 97,5% с эталонным спектром D (+)-

Рисунок 8. ИК-спектр фруктозы в образце Кавендиша после ферментации (Совпадение на 96 % с эталонным спектром D (-)-Fructose).

Анализируя рис. 3-8 можно констатировать, в целом, вполне приемлемый уровень совпадения для ИК-спектров, который составляет 85-95%. Получить уровень совпадений больше 98% достаточно сложно.

В таблице 3 приведены идентифицированные во время экспериментов химические группы, характерные для сахаров.

Таблица 3. Идентифицированные во время экспериментов химические группы ИК-полос в образцах сахаров.

Волновое число, см-1

Отнесения колебаний
и функциональные группы

3540-3200

Валентные ОН колебания

2990-2877

Ассиметричные валентные колебания СН2, симметричные валентные СН2

1470-1265

Деформационные СН2, деформационные СН

1075-1000

Валентные С-О

Ниже 950

Деформационные колебания ОН групп


Таким образом, анализ качественного состава сахаров в образцах табака до и после ферментации подтверждается сравнением их ИК-спектров с эталонными и подтверждает наличие только глюкозы и фруктозы. Другие сахара в образцах обнаружены не были, что позволяет сделать вывод о том , что именно эти присутствующие в образцах растворимые углеводы являются источником образования новых химических продуктов в ходе процесса суперферментации табака. Результаты количественного анализа экстрактов табака до и после ферментации, а так же соуса представлены в таблице 4.

Таблица 4. Структура сахаров в экстрактах табака до и после ферментации, а так же в соусе – инвертированном сиропе.

Показатель

Образец

Табак кавендиш до ферментации

Табак кавендиш после ферментации

Соус

Сахароза

< 0,1 г/л

< 0,1 г/л

< 0,5 г/кг

Глюкоза

0,39 г/л

0,55 г/л

324, 61 г/кг

Фруктоза

0,62 г/л

0,54 г/л

324,95 г/кг


В таблице 5 представлены данные о концентрации сахаров в исследуемых образцах табака.

Таблица 5. Концентрация сахаров в исследуемых образцах табака.

Сахар

Табак до ферментации,
несоусированный, г/г

Табак до ферментации соусированный
с добавлением 10% сиропа, г/г

Табак Кавендиш после ферментации, г/г

Глюкоза

0,020

0,047

0,028

Фруктоза

0,031

0,058

0,027

Сумма сахаров

0,051

0,105

0,055


Анализируя результаты, представленные в табл.5, необходимо отметить, что в процессе ферментации происходит уменьшение количества глюкозы и фруктозы в соусированном табаке в ходе технологического процесса.

Протоколы данных ионообменной хроматографии органических кислот (анионов) для образцов табака до (К1) и после (К2) ферментации представлены на рисунках 9.

Рисунок 9. Протокол данных ионообменной хроматографии органических кислот (анионов) для образцов табака до(К1) и после(К2) ферментации.

Консолидированные данные о содержании органических кислот в исследуемых образцах приведены в таблице 6.

Таблица 6. Содержание органических кислот образцов табака до ( К1) и после ( К2) ферментации.


Анион

Концентрация в К1, мг/л

Концентрация в К2, мг/л

Разница в конц. мг/л

1

хинной к-ты (quinate)

687.31

549.89

- 137.42

2

соляной к-ты

(chloride)

174.74

100.4

- 74.7

3

азотной к-ты

(nitrate)

155.28

56.73

- 98.55

4

яблочной к-ты

(malate)

355.13

798.24

+ 443.11

5

винной к-ты (tartrate)

45.96

0

- 45.96

6

серной к-ты

(sulfate)

163.25

117.33

- 45.92

7

фумаровой к-ты (fumarate)

80.28

5.7

- 74.58

8

фосфорной к-ты (Phosphate)

101.01

120.72

+ 19.71

9

Лимонной к-ты

(citrate)

440.82

251.07

- 189.75

10

Общее содержание кислот

2203.77

2000.07

- 203.7


Комментируя результаты табл. 6 необходимо подчеркнуть , что положительное значение параметра означает увеличение содержания кислот, отрицательное - уменьшение количественного параметра. Так же, необходимо отметить, что, согласно методу ионообменной хроматографии, проба образца после попадания на хроматографическую колонку элюируется раствором гидроксида натрия (щелочь), и таким образом, на детекторе анализируются анионы кислот, а не свободные кислоты. Кроме того, в рамках данной работы так же нами не ставилась и не решалась задача анализа содержания металлов в образцах табака.

Резюмируя результаты табл.6 следует подчеркнуть, что в результате изготовления Кавендиша уменьшается содержание всех обнаруженных органических кислот за исключением фосфорной и яблочной. Фактическая концентрация органических кислот , полученная в результате настоящего исследования качественного и количественного состава органических кислот, представлена в таблице 7.

Таблица 7. Концентрация органических кислот в табаке до и после ферментации.

Название кислоты

Концентрация в кавендише
до ферментации (экстракт, мг/л)

Концентрация в
кавендише
после ферментации (экстракт, мг/л)

Концентрация в кавендише до ферментации, мг/г

Концентрация
в кавендише
после
ферментации с учетом добавления сиропа, мг/г

Разница в
массе кислот после ферментации, мг

Измене-
ние, мМоль

Яблочная

355,1

798,2

17,755

36,28

18,53

0,14

Винная

46

0

2,3

0,00

-2,30

-0,02

Фумаровая

80,3

5,7

4,015

0,26

-3,76

-0,03

Лимонная

440,8

251

22,04

11,41

-10,63

-0,06


Результаты, представленные в табл. 7, наглядно демонстрируют уменьшение количества винной, фумаровой и лимонной кислот, при этом наблюдается существенное увеличение количества яблочной кислоты. Необходимо отметить, что увеличение количества яблочной кислоты происходит на 18,53мг в 1г табака (0,14 мМоль), а суммарное уменьшение остальных кислот происходит на 16,69 мг в 1 г табака. Таким образом, происходит общее увеличение содержания кислот за счет сильного увеличения количества яблочной кислоты. Кроме того происходит увеличение количества низкомолекулярных карбоновых кислот на 10% (оценка из интеграла суммы пиков хроматограммы), однако их идентификация затруднительна из-за невозможности их полного разделения.

Существенное увеличение яблочной кислоты возможно благодаря изменениям в структуре углеводов. Химизм получения яблочной кислоты из сахаров может быть реализован по следующей схеме :

глюкоза --> винная кислота--> оксалоацетат (щавелевоуксусная кислота, ЩУК) --> яблочная кислота.

Это наиболее короткие пути. Особенность превращения кислот заключается в том, что все эти превращения замкнуты в цикл с ответвлениями, причем выключение фермента на одном из звеньев приводит к его разрыву и сверхнакоплению определенных веществ.

Яблочная кислота может быть нейтрализована. На рисунке 10 приведена реакция нейтрализации яблочной кислоты гидроксидом натрия, продукт реакции - соль (малат натрия) и вода.

Рисунок 10. Диаграмма химической реакции нейтрализации яблочной кислоты.

Так же можно дополнительно отметить, что яблочная кислота - Е296 представляет собой бесцветные кристаллы, быстрорастворимые в воде и спирте. При температуре 100 градусов яблочная кислота легко плавится. Растения махорки и табака содержат яблочную кислоту в виде никотиновых солей. Пищевая добавка Е296 разрешена для использования в пищевой промышленности, полностью безопасна для употребления в пищу и часто используется в качестве регулятора кислотности и консерванта. Таким образом, технология горячей суперферментации табака позволяет получать продукт с естественными консервирующими свойствами, что очень важно при организации длительного хранения табачных изделий.

По результатам проведенного исследования можно сделать следующие основные выводы:

-в химических реакциях сахаров, сопровождающих процессе изготовления Кавендиша открытым способом суперферментации , участвуют, в основном, глюкоза и фруктоза; для оценки содержания глюкозы и фруктозы в табаке и соусе предлагается метод ферментативного анализа или химический метод, описанный в статье [7], поскольку данные методы обладают высокой селективностью по отношению к определяемым компонентам. Метод определения содержания углеводов восстановлением фелинговой жидкости (метод Бертрана) является неселективным т.к. на его результаты могут повлиять содержащиеся в образце альдегиды.

-закисление (снижение pH) табака связано с изменением состава органических кислот (основное уменьшение – лимонная, основное увеличение – яблочная) с увеличением общего содержания за счет яблочной кислоты. Существенное увеличение яблочной кислоты возможно благодаря изменениям в структуре углеводов. Для количественного определения яблочной кислоты может быть использован метод ионообменной хроматографии или метод кондуктометрического титрования солями лантана [8].

Литература:

1. Патент на полезную модель 56123. Устройство для ферментации табака/ И.В. Моисеев, В.В. Лезный. – Заявка № 2006114129 от 27.04.2006, опубл. 10.09.2006, Бюл. № 25.

2. И.В.Моисеев, М.Б. Мойсеяк, В.В. Лезный, Р.П. Приходько, Д.И. Моисеев,. Изменение углеводного состава табачного сырья при производстве табака Cavendish. Сахар. №9, 2012. 41-43с. ISSN 0036-3340.

3. Перри С., Амос Р., Брюер П. Практическое руководство по жидкостной хроматографии. пер. с англ., М. МИР, 1974

4. Риман В., Уолтон Г. Ионообменная хроматография в аналитической химии, пер. с англ., М., 1973

5.Сильверстейн Р., Вебстер Ф., Кимл Д. Спектрометрическая идентификация органических соединений.Бином. Лаборатория знаний. 2011.

6. Ageing/ http: //legacy.library.ucsf.edu/tid/xdd90a00/pdf

7. Писарев Д.И., Новиков О.О., Безменова М.Д. и др. Разработка метода количественного определения моносахаров в плодах черемухи поздней – Padus Serotina (EHRH.) AGARDH / Научные ведомости серия медицина. Фармацевтика. 2010 №22 (93) вып. 12/2

8. М.Р.Ф. Эшворт. Титриметрические методы анализа органических соединений. Москва. Химия. 1968. стр.306.