Погарская Фабрика

Микробиологический мониторинг трубочных смесей ПССФ.

Микробиологический мониторинг трубочных смесей ПССФ, изготовленных на основе табачного сырья различных типов послеуборочной обработки , в условиях изменений режимов хранения.

д.т.н. Моисеев И.В., к.в.н. Бовкун Г. Ф., Лёзный В.В., Симдянова Т.П., Приходько Р.П., д.м.н. Бурцева Е.А., к.т.н. Mойсеяк М.Б.

Микроорганизмы являются постоянными обитателями растений и сырья растительного происхождения. Различные группы микроорганизмов могут находиться на поверхности или внутри различных частей растений, их корней, семян, плодов, часть из них (фитопатогенные) могут приводить к болезням растений и порче как собственно растительного сырья, так и продукции, которая изготавливается из такого сырья [ 1] . Табачное сырьё может инфицироваться патогенными микроорганизмами на всех этапах обработки (сбор, первичная обработка, ферментация), хранение и переработка. Усугубляющими неблагоприятными воздействиями могут быть: избыточная влажность, пыль, насекомые, грызуны и другие факторы, повышающие вероятность микробного обсеменения.

Дополнительный актуалитет данный факт приобретает в условиях хранения ( в том числе, винтажного и длительного складского) для таких табачных изделий как трубочный табак и сигары (сигариллы), поскольку повышенная влажность и температура могут являться необходимыми каталитическими факторами для созревания (достижения необходимой кондиции физико-химических свойств) табачных изделий. Данная проблематика так же может приобретать усугубляющую тональность в случае использования табачного сырья теневой (DAC — Dark Air Cured ) и воздушной сушки (AC — Аir Сured), послеуборочная технология производства которых не подразумевает какую-либо термическую обработку, а следовательно данные типы табака потенциально могут являться источником микробиологической агрессии и контаминации, следствием которых может стать потеря товарного вида и потребительских качеств табачных продуктов.

Микроорганизмы, населяющие табачные растения и находящиеся на табачном сырье, можно разделить на две группы:

— представители нормальной микрофлоры растений;

— фитопатогенные микроорганизмы — возбудители заболеваний растений.

Нормальная микрофлора растений представлена ризосферными и эпифитными микробами. Для табачного сырья в силу специфики сбора характерна в большей степени эпифитная микрофлора, находящаяся на надземных частях растений. По качественному составу она довольно однообразна, типичными её представителями являются: Pseudomonas furbicola aurum — грамотрицательные короткие подвижные палочковидные бактерии, образующие колонии золотистого цвета на МПА (мясопептонный агар); Pseudomonas fluorescens — полиморфные грамотрицательные палочковидные бактерии с полярно расположенными жгутиками, обусловливающие флуоресценцию при росте на МПА и МПБ (мясопептонный бульон). Реже встречаются споровые бактерии Bacillus mesentericus, плесневые и дрожжевые грибы. Эпифитные микроорганизмы являются антагонистами фитопатогенных бактерий, защищая растения от заболеваний[2].

Химический состав табачного сырья, в том числе, значительное содержание белков, углеводов, различных аминокислот обусловливает возможность пролиферации гнилостных бацилл и плесневых грибов. Основными причинами порчи табачной продукции современные исследователи считают поражение плесневыми грибами [3].

Табачные плантации могут поражаться фитопатогенной микрофлорой, в спектре которой доминируют грибы (пятнистая болезнь, мучнистая роса, пероноспороз). К фитопатогенам относят вирусы (табачной мозаики), микоплазмы (мокрый монтарен) [4, 5 ]. Фитопатогены, в частности, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, проникая в растения, проявляют фитопатогенные свойства благодаря наличию ферментов, вызывающих мацерацию растительных тканей [ 6 ].

Проникать в ткани травянистых растений могут возбудители зооантропанозов: Yersinia enterocolitica, Yersinia intermedia [7]. Высокую вероятность проникновения в сосудистую систему табака, колонизацию листьев имеют бактерии рода Bacillus, обитатели почвы, имеющие необычайную устойчивость спор к химическим и физическим факторам воздействия. По современным представлениям аэробные спорообразующие бациллы объединены в род Bacillus, семейства Bacillacea, аэробная природа которых может быть строгая или факультативная. Все представители рода имеют палочковидную форму, характеризуются продукцией каталазы [ 8 ]. Типовый вид рода – Bacillus subtilis (сенная палочка), образует особые структуры — бактериальные эндоспоры, не погибающие при длительном кипячении, при этом термоустойчивостью характеризуются и вегетативные клетки [ 9 ]. К активным аммонификаторам, широко распространённым в почве, относят и других представителей семейства Bacillacea, таких как Bacillus mesentericus (картофельная палочка), Bacillus megaterium (капустная палочка).

Такие представители семейства Bacillacea как Bac.cereus, Bac.subtilis, Bac. megaterium могут вызывать госпитальные поражения (пневмонии, септицемии, эндокардиты, менингиты и др.) как у ослабленных больных, так и у потенциально здоровых людей при снижении иммунитета. Перечисленные поражения регистрируют сравнительно редко, однако их развитию у человека способствуют широкая распространенность бацилл в окружающей среде и высокая устойчивость их спор к различным воздействиям [ 8 ]. Патогенное действие, клинически проявляющееся гастроэнтеритом человека на фоне отравления первого и второго типа пищевыми продуктами, установлено у Bac.cereus, при концентрации в подозрительных продуктах 5 lg КОЕ/г. Bac.cereus спорадически вызывает эндокардиты и менингиты у лиц с протезированными органами, катетарами, гемодинамическими расстройствами, у длительно получавших цитостатики и иммунодепрессанты [ 8 ]. Кроме того, растительное сырьё и продукция с высокой обсемененностью патогенными микробами могут вызывать такие инфекционные заболевания у людей как кишечный иерсиниоз, листериоз, псевдотуберкулез, микотоксикозы [2].

В этой связи, микробиологический мониторинг табачной продукции, потребление которой связано с необходимостью тактильного и орального соприкосновения с обработанными (необработанными) листьями табака (сигары и сигариллы без фильтра на основе натурального листа, жевательный или сосательный табак, трубочный табак, табак для самокруток) представляется достаточно актуальной задачей с точки зрения общественного здоровья. Для самих же производителей такой продукции собственно решение задачи обеспечения микробиологической защиты и изделий, и потребителя является объектом постоянного совершенствования общей технологии как в части подготовки табачного сырья к производству, так и изготовления готовых табачных изделий с необходимыми санитарно-гигиеническими аспектами подготовки оснастки, рабочих поверхностей оборудования, спец. одежды и персонала.

Целью настоящей работы является исследование длительности срока хранения трубочных табаков АО ” ПССФ” в условиях температуры и влажности, находящихся выше порога микробиологической активности для растительного сырья, с использованием разработанной технологии подавления микробиологической агрессии.

Объекты исследования.

В качестве объектов исследования выбраны образцы серийной продукции трубочных табаков серии “Табак трубочный из Погара», рекомендуемых как для потребления в чистом виде, так и для индивидуального блендинга, соответственно — Берлей (образец №1), Вирджиния (образец №2), Ориентал (образец №3), а так же номерная, — готовая к употреблению “Смесь № 10”(образец №4). Исследуемые образцы являются характерными представителями различных типов послеуборочной сушки табака, соответственно, AC- воздушная для образца №1 , FCV – трубоогневая для образца №2 и SC – солнечная для образца №3. Образец №4 представляет собой смесь табаков различных видов сушки. Химический состав и характеристика объектов исследования приведён в табл.1.

Табл.1 . Химический состав и характеристика исследуемых табаков.

Методы исследования: мониторинг качества табачных изделий при хранения осуществлялся на основе визуального исследования согласно ГОСТ 52463-2005 “Табак и табачные изделия” [ 11 ] и микробиологических исследований с целью определения количества спор грибов, почвенных бацилл. Основное содержание экспериментальных работ включало:

▪ визуальный мониторинг табачных изделий при разных условиях хранения с определением влажности изделий и окружающей среды;

▪ микробиологический мониторинг табачных изделий при разных условиях хранения.

Комплекс исследовательских работ был проведён в лабораториях АО “ПССФ”( cвидетельство регистрации № 650 от 30 марта 2018 года) и ГОУ БГСА .

Материалы и методы исследования

Исследование образцов табачных изделий проводилось с сентября 2016 года по февраль 2018 года. Для получения экспериментальных данных по влиянию влажности и температуры на готовые изделия:

— 8 образцов табаков были расфасованы в герметичные пакеты и помещены в термостат при температуре 370С и относительной влажности камеры 80%;

— 8 образцов табака той же товарной партии были помещены в термостат при температуре 250С и относительной влажности камеры 80%.

Для микробиологического мониторинга состояния аналогичных образцов продукции без упаковки, пробы данных табаков поместили в чашки Петри, а затем — в эксикатор, влажность в котором составляла 100% при комнатной температуре 18-22С. При этом, изначальная влажность образцов составляла 16 % в соответствии со спецификацией данных продуктов АО “ПССФ”.

Исходная влажность образцов табака и температурно – влажностные режимы эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2. Температурно-влажностные режимы эксперимента

Примечание: Индекс “Б” в наименовании образцов означает использование в технологии производства трубочных табаков препарата “Биопаг” [ 12 ] и финишную обработка продукта перед упаковкой коротковолновым УФ- облучением [17] .

В рамках мониторинга осмотр проб табака проводили ежемесячно:

▪ на наличие признаков вегетации эпифитной микрофлоры (появление белого налета, ветвистого мицелия грибов);

▪ появлению характерного гнилостного запаха.

Наличие выявленных признаков обуславливало необходимость микроскопического и микробиологического исследования проб табака.

Наличие почвенных бацилл, их спор, мицелия и спор грибов обнаруживали микроскопией препарата «раздавленной капли» под увеличением х 400. Микробиологическое исследование выполняли посевом образцов с признаками порчи на среду КМАФАнМ [13 ] и среду Сабуро [ 14 ].

Спустя 7 месяцев хранения определяли влажность образцов по ГОСТ 28606-90 “Сырье эфирномасляничное, цветочно-травянистое. Методы определения влаги.” согласно [ 15 ] . Расчёт влажности проводили по формуле:

W = (m — m1)/m x 100,

Где m – масса навески сырья до высушивания, г;

m1 – масса навески сырья после высушивания, г;

100 – коэффициент пересчета в проценты.

За период хранения образцов в термостатах было установлено снижение влажности табака, поэтому образцы обработали стерильной дистиллированной водой и продолжили хранение при установленном режиме, но поместив в эксикаторы с влажностью 100-80%.

После окончания срока хранения образцов Ориентал, Ориентал-Б, Смесь №10, Смесь №10-Б, Берлей, Берлей-Б, Вирджиния, Вирджиния-Б который составил 8 месяцев при разных условиях, была определена влажность табака cогласно [15].

Общий срок наблюдения образцов трубочного табака: Ориентал, Ориентал-Б, Смесь №10, Смесь №10-Б, Берлей, Берлей-Б, Вирджиния, Вирджиния-Б при температуре 37и 25составил 17 месяцев. По завершению данного срока определяли влажность образцов согласно [15] и наличие спор КОЕ/г микрофлоры и грибов.

Контаминацию спорами микрофлоры представленных образцов табака изучали бактериологическим исследованием — посевом 1 г табака на агаризированные питательные среды (КМАФАнМ – определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов посевом на питательные среды), с определением КОЕ/г и идентификацией колоний по морфологическим и культуральным свойствам. Для определения спор грибов 1 г табака образцов сеяли на среду Сабуро, с подсчетом выросших колоний и определением КОЕ/г.

Цифровые данные( КОЕ/г) обрабатывали для выявления статистически значимых различий по Плохинскому Н.А.[10].

Обсуждение и результаты.

 

1. Результаты микробиологического исследования табачных изделий до хранения

 

Результаты бактериологического и микологического исследование образцов, упакованных в герметичные пакеты перед хранением, с определением КОЕ/г микрофлоры и грибов, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Бактериологические и микологические показатели исследуемых образцов перед хранением , (КОЕ/г) 

Представленные образцы характеризовались низким содержанием спор сенной палочки (Bac.subtilis), капустной палочки (Bac. megaterium). Количество спор в 1 г ( КОЕ/г) составляло от 1 до 5. Установленная плотность обсеменения свидетельствовала о слабом вегетировании почвенных бацилл при создании оптимальных условий, однако образование крупных колоний капустной палочкой и ползучий рост (с роением) сенной палочки визуально мог вызвать порчу табака.

Исследуемые образцы содержали споры грибов пенициллиумов и аспергилл – обитателей почвы, количество спор было незначительным от 4 до 16 в 1г табака.

Образцы, обработанные Биопагом, также содержали микрофлору, но показатель КОЕ/г был существенно меньше, чем в образцах табака без обработки; разница подтверждалась статистически ( td =2.52, Р≤ 0,5).

Споры плесневых грибов были обнаружены в образцах табака, обработанного Биопагом, частота выделения составляла 50%, однако при этом разница показателя КОЕ/г не подтверждалась статистически.

2. Результаты визуального мониторинга табачных изделий во время хранении

Результаты визуального исследования образцов табака, расфасованного в пакеты и в чашки Петри за 5 месяцев наблюдения представлены в табл.4.

Таблица 4. Результаты визуального исследования табака в течение 5-месячного наблюдения

В конце первого месяца хранения образцов табака при температуре 37С , 25С как в пакетах, так и при комнатной температуре в чашках Петри признаков вегетации микрофлоры (наличие налета, запаха) обнаружено не было.

Исследуемые образцы в конце второго месяца хранения не имели никаких признаков поражения микрофлорой. Отсутствие микробного поражения табака в пакетах: Вирджиния, Вирджиния-Б, Берлей, Берлей-Б, Ориентал, Ориентал-Б при температуре 37С , 25С, а также в чашках Петри при комнатной температуре отмечали на протяжении всего 5-ти месячного срока наблюдения.

Все смеси в конце 3-го, 4-го, 5-го месяца хранения так же не имели признаков микробного поражения.

Таблица 5. Результаты мониторинга образцов табака в течение 4-х последующих месяцев

В течение 6-7-ми месячного хранения образцов табака в пакетах и в чашках Петри признаков микробной порчи не установлено, однако образцы табака в герметичных пакетах, хранившихся при температуре 37С, 25С и влажности в камере термостатов 80% потеряли влагу, их относительная влажность составляла от 5,22% до 14%, причём лучше сохраняли влажность образцы, обработанные Биопагом. Образцы, хранившиеся в чашках Петри и в эксикаторе при 100%-ной влажности в условиях комнатной температуры, адсорбировали влагу и показатели их влажности находились в диапозоне от 62 до 19%.

В связи с потерей влаги табаком, хранившимся в пакетах, образцы обработали стерильной дистиллированной водой, показатели относительной влажности представлены в таблице 5, они составляли от 16,99 до 52,22% и поместили пакеты в эксикаторы при 100-80%-ной влажности, а затем в термостаты при испытуемой температуре.

Трубочный табак четырех образцов находился на хранении при комнатной температуре, в эксикаторе, влажность в камере составляла от 80 до 100%. Результаты визуального мониторинга этого вида табачных изделий на протяжение 11 месяцев представлены в таблице 6, данные которой свидетельствуют об отсутствии микробного поражения и незначительном понижении влажности табака.

Таблица 6. Результаты мониторинга образцов табака в течение 8-11-месячного хранения

В конце 8-месячного хранения не установлено признаков микробной порчи табака, расфасованного в пакеты и в чашках Петри. Такие же результаты отмечали после 9- ти и 10-месячного хранения. После 10 месяцев хранения, на протяжении 11-го месяца хранения все образцы табака, расфасованного в чашки Петри, имели признаки вегетирования как сенной палочки, так и грибов аспергилл, дневная комнатная температура в этот период составляла 250С и выше. Табак, хранившийся без упаковки, адсорбировал влагу, находился в аэробных условиях, что способствовало незначительному росту и развитию сенной палочки, грибов аспергилл.

Таблица 7. Результаты мониторинга образцов табака 12-17-месячного хранения

Образцы табачных изделий в упаковке с влажностью свыше 16%: Вирджиния, Вирджиния-Б, Смесь №10, Смесь №10-Б, Ориентал, Ориентал-Б, Берлей, Берлей-Б, хранившихся в эксикаторе с влажностью в сосуде 80-100% при температуре 37С в течение 17 месяцев не имели признаков микробных поражений. Аналогичные результаты были получены при испытании сроков хранения табачных изделий при температуре 25С. Исключение составил табак Берлей, для которого визуально было отмечено поражение аспергиллами и сенной палочкой с последующим подтверждением микробиологическими исследованиями только после 15 месяцев хранения при температуре 250 С, что обусловлено повышенным содержанием субстратов (углеводов, белков) для микрофлоры [ 16 ].

3. Результаты микробиологического мониторинга табачных изделий после окончания хранения

Микробиологическое исследование всех образцов табачных изделий без признаков микробной порчи после хранения не выявило изменения состава почвенных бацилл и грибов.

Таблица 8. Бактериологические и микологические показатели образцов табака после окончания хранения (КОЕ/г)

Образцы табачных изделий Вирджиния, Вирджиния-Б, Смесь №10, Смесь №10-Б, Ориентал, Ориентал-Б, Берлей, Берлей-Б, не имевшие признаков микробной порчи после 17-месячного хранения при исследовании содержали споры почвенных бацилл и плесневых грибов.

Спектр почвенных бацилл был представлен сенной палочкой (Bac.subtilis), наибольший показатель КОЕ 15/г был отмечен в образце Вирджиния, капустной палочкой (Bac.megaterium) –КОЕ-6/г , соответственно, в образце Ориентал.

В образцах содержались единичные споры плесневых грибов из рода Penicillium и вида Aspergillus fumigatus, 16-2 КОЕ/г.

Количественный показатель спор почвенных бацилл в образцах, хранившихся при 25С был выше М= 8,7 при том, что среднее арифметическое М спор гнилостных бацилл образцов табака, хранившихся при 37С, составляло 2,8 , а разница подтверждалась статистически ( td=2,2; P≤0,5).

Количество спор грибов в образцах, хранившихся при 370С М=7,2 и при 25С М=5,6 не имело существенных различий и не подтверждалось статистически (td=0,57; P≥0,5).

Образца табака, обработанные Биопагом, после 17-месячного хранения при температуре 37С, были значительно меньше контаминированы спорами почвенных бацилл( td =4,6, Р≤ 0,001), что подтверждалось статистически.

Заключение и выводы:

Исследуемые образцы табачных изделий содержат эпифитную микрофлору, представленную почвенными бациллами: Bac.subtilis (сенной палочкой), Bac megaterium (капустной палочкой), плесневыми грибами вида Aspergillus fumigatus (аспергиллами) и грибами из рода Penicillium (пенициллиумами), в незначительных количествах ( КОЕ/г). Выделенные микроорганизмы при возможности вегетирования формируют крупные колонии и характеризуются ползучим ростом, что визуально обеспечивает признаки порчи табачных изделий.

Обработка Биопагом статистически достоверно понижала контаминирование табака спорами почвенных бацилл в течение 17-месячного хранения при температуре 370С, но не оказывала влияние на споры грибов.

Хранение образцов табачных изделий в упаковке в камере термостатов при влажности 80%, как при температуре 370С, так и при 25С в течение 7 месячного хранения понижает содержание влаги табака.

Спектр выделенной микрофлоры табачных изделий до и после хранения не имели существенных различий. Температура 250С наиболее благоприятна для сохранения спор почвенных бацилл в образцах табака Вирджиния, Вирджиния-Б, Смесь №10, Смесь №10-Б, Ориентал, Ориентал-Б, Берлей, Берлей-Б, что подтверждалось статистически.

Признаки микробной порчи образцов табака Вирджиния, Вирджиния-Б, Смесь №10, Смесь №10-Б, Ориентал, Ориентал-Б, Берлей, Берлей-Б с влажностью от 19 до 62% без упаковки в чашках Петри при влажности в сосуде 100-80% в условиях комнатной температуры от 18 до 250С появлялись в течение 11-го месяца хранения и были обусловлены вегетированием плесневых грибов и почвенных бацилл.

Хранение упакованных табачных изделий Вирджиния, Вирджиния-Б Смесь №10, Смесь №10-Б, Ориентал, Ориентал-Б, Берлей-Б при влажности свыше 16% в эксикаторе (относительная влажность в сосуде 100-80%) при температуре 37и 25в течение 17 месяцев не вызывает микробную порчу.

Срок хранения образца Берлей при влажности свыше 16% в эксикаторе (относительная влажность в сосуде 100-80%) при температуре 25составляет 15 месяцев. Микробная порча обусловлена вегетированием грибов аспергилл и сенной палочки.

Используемая литература:

 

  • И.Г.Ильяшенко, Т.В. Пичугина, Л.Н. Шабурова. Микроорганизмы и окружающая среда: учебное пособие. ISBN 978-5-9920-0096-2 , — М., Издательский комплекс МГУ ПП, 2009, 104 с.

2. http://www.pandia.ru/text/77/415/29691.php

«ФИТОПАТОГЕННАЯ МИКРОФЛОРА. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СЫРЬЯ И ГОТОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ». Методические рекомендации для студентов фармацевтического факультета «Фитопатогенная микрофлора. Микробиологические методы исследования лекарственного сырья и готовых лекарственных форм».- Омск, 2005.- 19 с.

3. Т.В. Плотникова, Л.М. Соболева. ВИДОВОЙ СОСТАВ ВРЕДНОЙ БИОТЫ В ТАБАЧНОМ АГРОЦЕНОЗЕ КУБАНИ. Часть 1 — БОЛЕЗНИ ТАБАКА. / Tobacco-Ревю, № 3, 2013 г., с. 32-35.

4. Филипчук О.Д. Научные основы эко­логизированной защиты табака от вредных организмов: дис. д-ра с.-х. наук. — Краснодар, 2000. — 518с.

5. Рудаков В.О. Распространение ми­кроорганизмов, вызывающих корне­вые гнили овощных культур и меры защиты от них. Гавриш. – 2004№ 3, c. 13-15.

6. Воронкович И.В. Выживаемость фитопатогенных бактерий в природе. — М., 1974. 214 с.

7. В.А. Гордейко, Н.М. Шустрова . Иерсинии в растениях. ЖМЭИ. -1990, № 11, c. 16-18.

8. Поздеев О.К. Медицинская микробиология. 3-е изд.,- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005, 768 с.

9. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология. М.: Изд. «Мир», 1992, 472с.

10. Плохинский Н.А. Биометрия. Новосибирск, 1961 г., 362 с.

11. ГОСТ 52463-2005 Табак и табачные изделия. Термины и определения.

12. https://www.infodez.ru/production/biopag-d/biopag_d-sert.pdf

13. ГОСТ 10444.15-94 Продукты пищевые.

Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов

14. ГОСТ 10444.12-2013

Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных.

Методы выявления и подсчета количества дрожжей и плесневых грибов

15. ГОСТ 28606-90 Сырье эфиромасличное цветочно-травянистое. Методы определения влаги.

16. И.В.Моисеев , Н.В. Пуздрова, Д.Г. Кротов .Физико-химические аспекты технологического процесса тостирования берлея. Товассо-РЕВЮ, 2006, №2, С. 36-55.

17. https://kgrant.ru/uv-lamp-application-in-medicine-the-practice-of-using-ultraviolet-lamps-in-everyday-life/

Рис.1. Микробная порча Берлея после 15-ти месячного хранения при температуре 250С

Рис.1. Микробная порча Берлея после 15-ти месячного хранения при температуре 250С

Рис .2.Образцы табачных изделий содержат споры эпифитной микрофлоры, представленной сенной палочкой

Рис. 3. Признаки микробной порчи образцов табака влажность от 19 до 62% без упаковки после 11- месячного хранения при комнатной температуре.