Содержание

Моисеев И.В., д.т.н., профессор,  д-р Хайко Беренс (DTM),  Подкопаев Д.О., к.т.н.,

Кротов Д.Г., к.с.-х.н, доцент,  Кротова Е.А.,  Мойсеяк М.Б., к.т.н., доцент,

Лёзный В.В.,  Приходько Р.П.,  Симдянова Т.П.,  Коржнев Е.Н., к.т.н.

 

Введение

В ранее проведенных исследованиях [1,2] достаточно подробно изложены теоретические аспекты основных химических реакций, протекающих при производстве трубочного табака Кавендиш, а так же приведены результаты исследования изменений химического состава различных ботанических сортотипов исходного табачного  сырья в течение непрерывного 20-дневного технологического  цикла тепловой обработки табака в глюкозо-фруктозном сиропе. На рис. 1 приведена обобщенная схема комплекса необходимых исследований для описания количественных и качественных изменений химической структуры табачного сырья при изготовлении Кавендиша.

Рис.1. Обобщенная схема комплекса исследований для описания количественных и качественных изменений химического состава табачного сырья при изготовлении Кавендиша

Согласно рис.1 для уточнения  механизма сахаро-аминных реакций и процесса меланоидинообразования в Кавендише объектами исследования является изучение изменений содержания полисахаридов (крахмала), органических кислот и белковых веществ, в том числе, аминокислотного состава и продуктов их распада, - как для  исходного табачного сырья, так и для  Кавендиша, изготовленного открытым способом суперферментации.

Изменение углеводного комплекса табака

Исследования количественных изменений в составе крахмала является важным исследованием, поскольку именно полисахариды и продукты их распада, скорее всего, образуют сахаро-аминный комплекс с белками, что в итоге приводит к уникальным органолептическим свойствам дыма при пиролизе Кавендиша. В результате исследований содержания крахмала, которые осуществлялись ферментативным методом c помощью автоматического биохимического анализатора Кonelab arena 20xt, были получены следующие результаты: до технологического процесса с табачным блендом содержание крахмала в табачном сырье составляло 1,82 г/100 г, а в готовом Кавендише после окончания 20- дневного цикла - 1,19 г/100 г. Таким образом, во время изготовления Кавендиша содержание крахмала снижается на 35%, что может свидетельствовать об участии крахмала как в структуре обмена органических кислот [4], так и синтезе сложных веществ, являющихся продуктами реакции Майяра (химические взаимодействие продуктов  деструкции крахмала и аминных соединений), положительно влияющих на вкус дыма.

В работе [3] был проведен дифференцированный анализ изменений в составе низкомолекулярных углеводов и кислотного комплекса табачного сырья при изготовлении трубочного табака Кавендиш открытым способом суперферментации. При этом, в ходе экспериментальных исследований было дополнительно подтверждено, что процесс изменения соотношения органических кислот во время изготовления Кавендиша является следствием окислительной диссимиляции растворимых углеводов (глюкозы и фруктозы) за счет ферментативных превращений, входящих в цикл трикарбоновых кислот. При этом, в отличие от процессов томления и сушки табака во время послеуборочной обработки [4], - при изготовлении Кавендиша происходит обратная процессам сушки реакция - резкое увеличение содержания яблочной кислоты при уменьшении, в первую очередь, лимонной кислоты. Причём, на образование органических кислот, согласно [4], сильно влияет концентрация ионов аммония и нитрат-ионов, являющимися продуктами диссимиляции белков.

Исследование изменений  массовых долей органических кислот

На рис.2,3 представлены электрофореграммы органических кислот, содержащихся в исходном сырье и Кавендише. Исследование состава органических кислот осуществлялось по методике [6].

Дата: 27.08.2014  13:13:03

Оператор: MainUser

Файл  ЭФГ: C:\Program Files\Lumex\Elforun\оргкислоты\табак 2_140827_1313.mdf

Файл метода: C:\Program Files\Lumex\Elforun\оргкислоты\оргкислоты.mtk

Температура: 20.0 °C

Длина волны: 254

Проба:

Разбавление: 1.00

Буферный раствор: рабочий буфер

Этап 1. Время 299 сек, Напр. -20 кВ, Давл. 0 мбар, Длина волны 254 нм.

Метод расчета           

Абсолютная градуировка;

Внутренняя нормализация.

 

Программа:

1.Промывка. Из 9 в 9, t= 123 сек, U= 0 кВ, P= 1000 мбар.

2.Ввод пробы. Из 1 в 10, t= 5 сек, U= 0 кВ, P= 30 мбар.

3.Анализ. Из 10 в 10.

3.1. t= 299 сек, U= -20 кВ, P= 0 мбар, W= 254 нм.

Рис.2. Электрофореграмма органических кислот исходного сырья

при изготовлении Кавендиша

 

Дата: 27.08.2014  13:13:03

Оператор: MainUser

Файл  ЭФГ: C:\Program Files\Lumex\Elforun\оргкислоты\табак 2_140827_1313.mdf

Файл метода: C:\Program Files\Lumex\Elforun\оргкислоты\оргкислоты.mtk

Температура: 20.0 °C

Длина волны: 254

Проба:

Разбавление: 1.00

Буферный раствор: рабочий буфер

Этап 1. Время 299 сек, Напр. -20 кВ, Давл. 0 мбар, Длина волны 254 нм.

Метод расчета           

Абсолютная градуировка;

Внутренняя нормализация.

 

Программа:

1.Промывка. Из 9 в 9, t= 123 сек, U= 0 кВ, P= 1000 мбар.

2.Ввод пробы. Из 1 в 10, t= 5 сек, U= 0 кВ, P= 30 мбар.

3.Анализ. Из 10 в 10.

3.1. t= 299 сек, U= -20 кВ, P= 0 мбар, W= 254 нм.

Рис.3.Электрофореграмма органических кислот готового Кавендиша.

 

 

В таблице 1 представлено содержание органических кислот в исходном табачном сырье и готовом Кавендише.

Таблица 1 Содержание органических кислот в исходном табачном сырье и Кавендише

Как видно из представленных в таблице 1 результатах исследования, - в результате технологической обработки в Кавендише, по сравнению с исходным табачным сырьём, на 36,7 % увеличивается содержание органических кислот за счёт увеличения массовых долей, в первую очередь, яблочной, лимонной и щавелевой кислот, что приводит к смещению pH = 5,6 для исходного сырья к pH=4,12 для готового Кавендиша [3].

Изменение белкового комплекса табака

Ферментативные изменения в составе белков и аминокислот при изготовлении Кавендиша интересны прежде всего, с точки зрения, продуктов их диссимиляции, в первую очередь, процесса окислительного дезаминирования с образованием свободного аммиака и соответствующих кетокислот. Процесс дезаминирования аминокислот приводит к трансформации азотистых соединений в безазотистые, которая позитивно сказывается на изменении вкуса дыма ферментированного табака. Свободный аммиак в процессе дезаминирования может связываться органическими кислотами в виде аммонийных солей.

В ходе проделанной исследовательской работы были проанализированы образцы табака на наличие белков и пептидов. В результате работы были определены концентрации белка двумя методами–Лоури и Бредфорда [9]. Метод Лоури (метод Фолина-Чиокальто) основан на 2-х реакциях - биуретовой реакции в щелочной среде – взаимодействие между пептидными связями белков и Cu2+ c образованием Cu+, который далее вступает в реакцию с реагентом Фолина, и, cобственно, реакции Фолина-Чиакальто, которая заключается в восстановлении фосфомолибдовольфрамата до молибденовой сини за счет катализируемого медью окисления ароматических аминокислот. Метод Бредфорда основан на связывании белком красителя кумасси бриллиантового синего (Coomassie Brilliant Blue G-250) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом, увеличение абсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе.

Для спектрофотометрического  определения концентраций белка методами Бредфорда и Лоури применялся спектрофотометр Cary 50 Bio (Agilent), для гель-электрофореза использовалась ванна BIO-RAD Mini-Protean Tetra Cell, источник тока Electrophoresis Power Supply-EPS 3501. Пробоподготовка осуществлялась на центрифуге Еppendorf 5804 R. Для экстракции белков использовался фосфатный буфер с рН=8. Процедура экстракции заключалась в следующем: образец табака измельчался в кофемолке до состояния пыли (фракция помола: 0,5+0,04 мм).  Навеска измельченного табака (таблица 2) помещалась в мерный цилиндр, после чего измерялся её объем. К полученной навеске добавлялся равный объём буферного раствора, после чего масса растиралась в ступке в течение 3 минут.         После растирания масса отжималась, экстракт центрифугировался при комнатной температуре при скорости 7000 об/мин (угловой ротор) в течение 5 минут. Супернатант использовался для дальнейших исследований.

 

Таблица 2. Результаты пробоподготовки образцов

Концентрация белков в полученных растворах исследовалась, методами Бредфорда и Лоури. Результаты приведены в таблице 3.

 

Таблица 3. Результаты определение концентрации белков

Анализируя данные, представленные в таблице 3, можно сделать следующее выводы:

1.     Сильное различие в значениях концентраций, измеренных методами Лоури и Бредфорда объясняется тем, что метод Лоури специфичен как для высокомолекулярных (крупных) белков, так и низкомолекулярных пептидов (реакция основана на образовании комплекса с пептидной связью), тогда как метод Бредфорда рассчитан на определение высокомолекулярных белков. Таким образом, в экстракте табака, - особенно в Кавендише, - преобладают, в основном,  низкомолекулярные пептиды.

2.     В результате технологической обработки при изготовлении Кавендиша концентрация белковых веществ снижается, примерно, в два раза. Именно с этим фактом действующем на фоне увеличения кислотности табака во время суперферментации, в первую очередь, необходимо связывать улучшение вкуса и облагораживание аромата дыма Кавендиша по сравнению с исходным табачным сырьем.

Для определения фракционного состава белков в ходе работы был проведен гель-электрофорез в полиакриламидном геле [9]. Процедура пробоподготовки заключалась в следующем: к 500 мкл экстракта табака было добавлено 500 мкл раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Смесь охлаждалась в течение 10 минут при 4 0С и центрифугировалась 10 минут при 13 тыс. об/мин. После центрифугирования супернатант был слит, белок промыт 3 раза ацетоном для отмывки от ТХУ. Обработка ТХУ производилась с целью денатурации протеаз, осаждения и очистки исследуемых белков. Осажденные белки ресуспендированы в  раствор специального буфера в объеме 30 мкл для ПААГ-электрофорезa [9]. Далее растворы  были нагреты до 95 0С в течение 5 минут, после чего охлаждены и отправлены на анализ. На рис.4 представлена ПААГ-ДСН электрофореграмма исследованных растворов белков.

Треки: 1 – Маркер, 2 -  С 5 мкл, 3 - С 10 мкл, 4 - К  5 мкл, 5 - К 10 мкл, 6 - С осаждено ацетоном 5 мкл, 7 - С осаждено ацетоном 10 мкл, 8 - Косаждён ацетоном 5 мкл, 9 - КосаждЁн ацетоном 10 мкл.

Рис.4. ПААГ-ДСН электрофореграмма белков.

Образцы 6-9 были предварительно осаждены ацетоном сразу после стадии получения экстракта. Значения маркера соответствуют молекулярной массе белков в килоДальтонах( кДа).

Из рисунка 4 видно, что образцы ферментированного табака, практически, не содержат белков массой более 10 кДа. Кроме того, сплошные полосы неферментированного табака (треки - 2,3,6,7) свидетельствуют о большом количестве полимера. Cравнивая результаты, полученные в ходе анализов концентраций белков методами Бредфорда,  Лоури и данных электрофореза, можно сделать вывод, что белки, вероятнее всего, обладают сложным составом (гликопротеиды). В результате технологической обработки углеводный фрагмент разрушается, после чего остается только белковый. Таким образом, интенсивные полосы (треки - 2,3,6,7) обусловлены, вероятнее всего, наличием высокомолекулярных углеводных фрагментов.

При этом, при изготовлении экстрактов и последующем осаждении белков ацетоном было отмечено, что вначале эксперимента вся окраска раствора была сосредоточена в осажденных белках, но через некоторое время окраска начинала переходить в ацетон. Это может свидетельствовать о том, что в экстракте могут иметь место быть как высокомолекулярные красители, так и низкомолекулярные.

Это подтверждается результатами, приведенными в табл. 4 [2]. В работе [2] на основе определения общего содержания углеводов и белков (методика ЦИНАО) показано, что для табачного сырья Вирджиния снижение количества углеводов (метод Бертрана) во время технологического цикла снижается в 2 раза при полном исчезновении редуцирующих сахаров, причём на этом фоне более чем на 25% растет количество азотистых веществ за счет низко- и высокомолекулярных соединений. 

Таблица 4. Изменение  химического состава табачного сырья во время технологического цикла изготовлении Кавендиша( B – Вирджиния FCV, Б-Берлей)

Как видно из табл. 4, структура белкового комплекса табаков сортотипа Вирджиния (рH = 5,34), в отличие от табаков сортотипа Берлей (рH= 7,58), показывает увеличение азотистых веществ на 25,4% на фоне снижения уровня никотина (11%) и редуцирующих сахаров (100%), что характерно для процессов образования новых сахаро-аминных веществ как за счет собственных сахаров Вирджинии, так и углеводов соусов; уровень белков для табака Берлей (при использовании методики ЦИНАО напротив,- уменьшается, что на фоне появления незначительного количества углеводов (0,4-1,4%) и интенсивных окислительных процессов говорит, о менее эффективном, чем для Вирджинии процессе образования меланоидиновых белковоподобных комплексов.

Для понимания деталей химического процесса суперферментации важным фактором является  исследование продуктов деструкции белков – аминокислот и неорганических соединений азота, в частности, нитрат-, нитрит- и ионов аммония.

 Исследование аминокислот осуществлялось с помощью методов ВЭЖХ и капиллярного электрофореза [5,9]. Результаты исследований содержание основных аминокислот в образцах табачного сырья и ферментированного табака представлены на рис. 5,6 и табл. 5,6.

Рис.5. Хроматограмма аминокислотного состава исходного табачного сырья для изготовления Кавендиша

Рис.6. Хроматограмма  аминокислотного состава готового Кавендиша

Таблица. 5. Количественные  изменения  аминокислот  в исходном табачном сырье и Кавендише  при использовании автоматического аминокислотного анализатора на основе ВЭЖХ

Табица. 6. Количественные изменения аминокислот в исходном табачном сырье и Кавендише при использовании метода капиллярного электрофореза

Исходя из результатов,  представленных в табл. 5, 6, - можно сделать вывод о том, что в процессе суперферментации табака происходит глубокая деструкция белков, которая не сопровождается накоплением аминокислот. Последний факт подтверждается снижением содержания, практически, всех присутствующих в образце ферментированного табака аминокислот. Вероятнее всего, продуктами дальнейшей деструкции аминокислот являются низкомолекулярные азотсодержащие органические соединения, а также неорганические соединения азота в виде нитрат-, нитрит-, и ионов аммония.

Исследование катионного и анионного состава табака

Результаты исследования неорганических анионного и катионного составов  исходного сырья и готового Кавендиша представлены  на рис. 7-10 соответственно.

Рис.7. Результаты исследования катионного состава исходного табачного сырья для изготовления Кавендиша

Рис.8. Результаты исследования катионного состава готового Кавендиша

Рис.9. Результаты исследования анионного состава исходного табачного сырья для изготовления Кавендиша

Рис.10. Результаты исследования анионного состава готового Кавендиша

 

Обобщённые результаты изменения катионного и анионного состава при изготовлении  Кавендиша представлены в таблице 7.

Таблица 7. Содержание неорганических  катионов и анионов в табачного сырье для Кавендиша и готовом Кавендише, % на абс. сух. вещество

Примечания: 1) Содержание неорганических анионов-катионов в (%) приводится при пересчёте на абсолютно сухое вещество; 2)  содержание  неорганических  анионов – катионов определялось по  методикам [7,8]

Комментируя  результаты таблицы 7 , можно констатировать следующее:

  •  Содержание анионов - нитратов, хлоридов и сульфатов в готовом Кавендише снизилось. Предположительно, нитраты и сульфаты в процессе созревания табака могли или перейти в газообразные продукты и улетучиться в атмосферу или остаться в табаке в виде нерастворимых солей. Хлориды могли улетучиться в виде НСl с парами воды или в составе жидкой фракции, которая имела место быть  в процессе приготовления Кавендиша. Увеличение содержания фосфатов объясняется повышением их извлекаемости в готовом продукте по сравнению с исходным табачным сырьём. 
  •  Фосфор содержится в растениях в органических и минеральных соединениях. Обычно большая часть фосфора, содержащаяся в растениях (до 90 %), представлена различными органическими соединениями. В минеральной форме фосфор находится в виде солей ортофосфорной кислоты с кальцием, магнием, калием, аммонием и другими катионами. К органическим соединениям относятся нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды, фосфопротеиды, фосфатиды, фитин, сахарофосфаты, макроэргические и другие соединения. В процессе созревания Кавендиша могли происходить процессы разрушения сложных фосфорсодержащих органических соединений, что и привело к  переходу фосфора в подвижное состояние.
  • Содержание катионов - кальция, бария, магния снижается в результате возможной реакции образования малорастворимых сульфатов вследствие реакции в массе тачного сырья. Этим можно объяснить и снижение сульфатов.

           Mg2+ + SO42- = ¯MgSO4   

           Са2+ + + SO42- = ¯ СаSO4

  •  Сульфат кальция в воде растворим незначительно. Растворимость падает с повышением температуры: если при 20 C она составляет 0,2036 г/100 г воды, то вблизи точки кипения воды (100 °C) снижается до 0,067 г сульфата на 100 г воды.
  • Увеличение содержания натрия в готовом Кавендише объясняется тем, что натрий, являясь основным ионом клеточного сока в табаке, становится более доступным для экстракции в результате термохимического разрушения вакуолей клеток в процессе созревания Кавендиша. Ионы аммония обнаружены не были.

Выводы по работе:

-         при изготовлении Кавендиша содержание крахмала снижается на 35% - с 1,82 г/100 г в исходном сырье до 1,19 г/100 г после истечения 20- дневного технологического цикла. Таким образом, крахмал является активным участником как в структуре обмена органических кислот, так и синтезе сложных веществ, являющихся продуктами реакции Майяра и положительно влияющих на вкус дыма. В целях производственной идентификации эффективности процесса суперферментации есть смысл введения крахмального коэффициента суперферментации, равного отношению разницы содержания  крахмала в исходном сырье и Кавендише к количеству крахмала в исходном сырье в  (%%). Для используемых в данной работе образцов данный коэффициент деградации крахмала равен 34, 62 %;

-         метод Брэдфорда (по сравнению с методом Лоури, методикой ЦИНАО) является предпочтительным методом при исследовании концентрации белков и их прозводных в табачном сырье, а так же готовом Кавендише; в ходе эксперимента установлено снижение концентрации белков более чем в 2 раза (c 9,6 мг/г до 4,1 мг/г) по сравнению с исходным сырьём. Таким образом, метод Брэдфорда позволяет ввести для описания эффективности технологического процесса ещё  термин белкового коэффициента суперферментации, равный отношению концентрации белка в готовом Кавендише по отношению к исходному сырью в (%%). Для используемых в данной работе образцов данный коэффициент равен величине 42,7 %) и характеризует эффективность технологического процесса суперферментации по снижению уровня белков. Косвенно, данный коэффициент так же, в первом приближении, будет характеризовать количество белков, которые вступили во время технологического процесса в аминосахарные реакции; в процессе суперферментации табака происходит глубокая деструкция белков, которая не сопровождается накоплением аминокислот. В результате исследования установлено снижение содержания, практически, всех присутствующих в образцах аминокислот. Наиболее существенные изменения (более 80 %) касаются таких аминокислот, как лизин, фенилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, пролин, серин. Вероятнее всего, продуктами дальнейшей деструкции аминокислот являются низкомолекулярные азотсодержащие органические соединения;

-         Содержания неорганических катионов и анионов в Кавендише, как правило, снижается по сравнению с исходным табачным сырьем, что обусловлено сопровождающими технологический процесс химическими реакциями образования различных газообразных оксидов, либо испарением во время нагрева. Тем не менее, по некоторым элементам (фосфаты, натрий) исследования показывают увеличение концентрации. Возможно так же, что для более полного исследования данной группы анионов и катионов необходимо использовать другие методики определения концентрации на основе более сильных экстрагентов.

Литература:

1.Моисеев И.В.,  д-р Хайко Беренс,  Мойсеяк М.Б., Лезный В.В.,  Приходько Р.П.,  Симдянова Т.П. Теоретические аспекты формирования вкусо-ароматических  свойств дыма “Кавендиша”.  Профессиональный индустриальный журнал ’’Tobacco-Ревю’’( рег. cвид. ПИ N: 77-1936 от 15.03.2000 ),  N: 2(71), июнь 2014 г.,  cтр. 44-50.

2.Моисеев И.В.,  д-р Хайко Беренс,  Мойсеяк М.Б., Лезный В.В.,  Приходько Р.П.,  Симдянова Т.П. Комплексное использование  инструментальных  и органолептических методовконтроля качественных характеристик  ‘’ Кавендиша’’ [1]  из  различных  сортотипов табачного сырья – Вирджинии и Берлей. Профессиональный индустриальный журнал ’’Tobacco-Ревю’’( рег. cвид. ПИ N: 77-1936 от 15.03.2000 ),  N: 3(72),  август  2014 г.,  cтр. 46-56.

3.Моисеев И.В.,   Мойсеяк М.Б.,  Лезный В.В.,  Приходько Р.П.,  Симдянова Т.П., Подкопаев  Д.О.,   КоржневЕ.Н.  Дифференцированный анализ изменений в структурах  углеводного и кислотного комплексов табачного сырья при изготовлении трубочного табака Кавендиш открытым способом суперферментации.

Профессиональный индустриальный журнал ’’Tobacco-Ревю’’( рег. cвид. ПИ N: 77-1936 от 15.03.2000 ),  N: 4(73),  октябрь  2014 г.,  cтр.

4.Кретович В.Л. Биохимия растений Учебник. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Высшая школа, 1986. - 503 с.

5.JunjieZhang, ChunxiaZhao, YuweiChang,YanniZhao, QinghuaLi, XinLu, GuowangXu. Analysis of free amino acids in flue-cured tobacco leaves using ultra-high performance liquid chromatography with single quadrupole mass spectrometry. ReceivedApril 28, 2013, revisedJune 10, 2013,  acceptedJune 10, 2013.  J. Sep. Sci. 2013, 36, 2868–2877.

6. Определение органолептических кислот в винодельческой, соковой, алкогольной, безалкогольной и пивоваренной продукции. Методика М04-47-2012.

7. Определение неорганических катионов в воде. ПНД Ф 14.1:2:4.167-2000 (издание 2011г.) Методика М01-31-2011.

8. Определение неорганических анионов в воде ПНД Ф 14.1:2:4.157-99 (издание 2013г.) Методика М01-30-2009.

9. Уилсон К., Уолкер Дж. "Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии".  Пер. с англ. - БИНОМ. Лаборатория знаний , 2013, 849 с.