Исследование   динамики  изменений   химических  и  органолептических   свойств  табачного  сырья  в  процессе    тепловой  ферментации  в  соусной  среде  инвертированного  сахарного  сиропа.

 

Д.т.н. Моисеев И.В.,  к.т.н.  Подкопаев  Д.О. ,  к.т.н.  Кротов Д.Г.,  Кротова Е.А.,  Приходько Р.П.,  Лёзный В.В.,  Симдянова Т.П. ,  к.т.н. Филатова И.А.

 

Аннотация (abstract):   В статье  приводятся  результаты  комплексного  исследования динамики  изменений  химических  свойств табака  Кавендиш  и  органолептических  свойств  его  дыма  в  процессе  цикла дополнительной тепловой  ферментации  в  соусной  среде, содержащей  инвертированный  сахарный  сироп и высокоатомный спирт.  Результаты  комплексного  исследования обобщаются с помощью методов корреляционного и кластерного анализов.
 

1. Введение

 

 К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвящённых влиянию потребления табачных изделий на здоровье человека, исследованиям токсикологии табачного дыма. Кроме того, имеют место быть работы, где исследуется содержание различных химических веществ в различных ботанических сортотипах табака. Однако, тема исследования химического состава табака с учётом динамики изменений физико-химических характеристик табака в процессе тепловой ферментации в соусных средах на сегодняшний день остаётся малоисследованной. При этом, необходимо отметить, что подобное исследование могло бы не только помочь производителям табачных изделий лучше понять суть происходящих в результате ферментации изменений, подобрать параметры технологических процессов переработки с целью получения табака с заданными сенсорными характеристиками, но и получить актуальную информацию, позволяющую планировать дополнительные технологические возможности по формированию/изменению ароматического профиля бленда курительного табачного изделия без использования традиционных ароматизаторов, что особенно актуально на фоне усиления регуляторных воздействий государства на табачный бизнес в части существенного  прогресса  ограничений  использования не табачных добавок. 
 

Ярким представителем табаков с дополнительной тепловой ферментацией в соусной среде является Кавендиш. Кавендиш изготавливается и используется в качестве значимой компоненты при приготовлении трубочных смесей (pipe tobacco) и RYO-MYO (от англ. – Roll You Oun – ’’скрути себе сам’’ или Make You Own – ’’сделай себе сам’’). Процесс изготовления MYO часто называют тюбингом (от англ. Tubing - помещать в тубу). Кавендиш могут изготавливать открытым и закрытым способами в зависимости от требований к готовому продукту. Как правило, для изготовления Кавендиша используют смесь нескольких сортов Берлеев и Вирджинии. В зависимости от режимов тепловой ферментации (температура, влажность, химический состав соусной среды), химического состава табачного сырья, других внешних условий получаются различные табачные продукты с отличающимся вкусом и характерным ароматом дыма[1].

 

Содержащиеся в табаке химические вещества в целом можно разделить на несколько блоков, таких как:
 

  • Органические азотосодержащие вещества (белки, аминокислоты, никотин);
     
  •  Углеводы, продукты их трансформации (крахмал, глюкоза, фруктоза, органические кислоты);
     
  • Специфические органические вещества;
     
  •  Неорганические катионы и анионы.
     

Большую помощь в исследовании состава табака и в целом процессов его ферментации оказали исследования процессов ферментативной переработки таких продуктов как чай и кофе. Это связано с тем, что для исследования процессов ферментации табака могут быть использованы аналогичные методы исследования.
 

На заключительном этапе исследований важно найти взаимосвязь между технологическими характеристиками, содержанием химических веществ и сенсорными характеристиками табака в процессе ферментации. Для этого могут быть использованы методы математической обработки данных, такие как корреляционный и кластерный анализ. На основе данных математической обработки и имеющихся литературных данных можно сделать предположения и выводы о механизмах химических процессов, протекающих в результате дополнительной  тепловой ферментации табака в  различных  химически активных  средах.

 

2. Материалы и методы

 

2.1 Методика ферментации табака

 

Технология изготовления Кавендиша представляет собой последовательность технологических операций, включающих следующие основные действия:
 

  • увлажнение до 25-30% и разогрев до 55-600С, смешивание и кондиционирование табачного сырья;
     
  • равномерное нанесение на увлажнённое табачное сырьё разогретый до 650C  cоус  из инвертированного сахарного сиропа со степенью инверсии 92-95% и пропиленгликоля в суммарном  количестве до 10-15% от массы увлажнённого  табака;
     
  • размещение обработанного соусом табачного сырья в технологическую установку, представляющую собой прессовую камеру с размерами 1000 х 1000 х 300 мм и механический (гидравлический) пресс, обеспечивающий помимо равномерного давления 500-1000 кг/м2 на слой табачного сырья с толщиной 10-15 см, так же и равномерный прогрев этого слоя с 6-ти сторон. Помещённый в технологическую установку табак выдерживается до готовности в течение 15-20 суток при постоянном воздействии температуры 650С;
     
  • после окончания тепловой ферментации готовый Кавендиш подвергается резке на фрагменты заданной ширины и длины в зависимости от типа табачного изделия, в котором его будут использовать в качестве компоненты бленда;
     
  • резаный Кавендиш подвергают сушке до необходимого заданного значения влажности.

 

2.2 Исследование органических азотосодержащих веществ

 

2.2.1. Определение белков методами Бредфорда и Лоури.

 

     Для экстракции белков использовался фосфатный буфер с рН=8. Процедура экстракции заключалась в следующем: образец табака измельчался до состояния пыли (фракция помола: 0,5±0,04 мм). Навеска измельченного табака помещалась в мерный цилиндр, после чего измерялся её объем. К полученной навеске добавлялся равный объём буферного раствора, после чего масса растиралась в ступке в течение 3 минут. После растирания масса отжималась, экстракт центрифугировался при комнатной температуре при скорости 7000 об/мин (угловой ротор) в течение 5 минут. Супернатант использовался для определения белка методами Бредфорда и Лоури [2].

 

2.2.2 Определение содержания аминокислот

 

В данном исследовании было определено содержание 11 аминокислот.
 

Пробоподготовка заключается во взятии навески измельченного табака массой 100 мг и добавлении 10 см3 соляной кислоты (1:1), после чего пробирку закрывают и проводят кислотный гидролиз в течение 16 часов при температуре 1100С. После завершения гидролиза, пробу фильтруют. Далее отбирают аликвоту 0,05 см3 и упаривают под струёй горячего воздуха.

Затем получают ФТК-производные. После получения ФТК-производных раствор упаривают под струёй горячего воздуха. Затем добавляется 0,05 см3 дистиллированной воды и центрифугируется при 6000 об/мин в течение 5 минут. Анализ аминокислотного состава производится методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель 105» с положительной полярностью источника высокого напряжения (внутренний диаметр капилляра 50 мкм, полная длина капилляра - 75 см, эффективная длина - 65 см).

Метод основан на разложении проб кислотным гидролизом с переводом аминокислот в свободные формы, получении ФТК-производных, дальнейшем их разделении и количественном определении методом капиллярного электрофореза. Детектирование проводят при длине волны 254 нм. Температура - 300С. Напряжение 25 кВ.  Время анализа 13-15 минут. Давление - 0 мбар.

 

2.2.3. Определение содержания никотина

 

Определение никотина было произведено в соответствии с национальным стандартом  РФ - ГОСТ 30038-93 «Табак и табачные изделия. Определение алкалоидов в табаке. Спектрофотометрический метод». Для этого навеску 0,5 г измельченного табака переносят в колбу для отгонки с водяным паром и заливают 25 см3 дистиллированной воды, добавляют 20 г хлористого натрия и 5 см3 8Н раствора гидроксида натрия. Смесь перегоняют в мерную колбу вместимостью 250 см3, содержащую 10 см3 2Н раствора серной кислоты. Собирают 220 см3 дистиллята, после чего доводят объем мерной колбы до 250 см3. Далее полученный раствор разбавляют дистиллированной водой в 4 раза раствором 0,05Н серной кислоты. С помощью UV-спектрофотометра проводят измерение оптической плотности при 236 -, 259 - и 282 нм. В качестве фонового раствора используют 0,05Н раствор серной кислоты. Расчет никотина в % ведут по формулам:

 

где:

А - экстинкция, b - влажность табака, l - длина кюветы, m - масса пробы (0,5г), V1=250 см3, V2=25см3, V3=100 см3.

 

2.3 Определение содержания углеводов и продуктов их диссимиляции

 

2.3.1 Определение содержания глюкозы и фруктозы

 

В коническую колбу на 100 мл помещено 0,3 г табака и прилито 70 см3 дистиллированной воды. Содержимое колбы перемешивалось в течение часа с помощью магнитной мешалки. Объём смеси доведён водой до 100 см3. Экстракт отделён от осадка табака фильтрованием.

В колбу на 25 см3 помещено 1,25 см3 85 мМ  гексацианоферрата  калия и 1,25 см3 250 мМ сульфата цинка, 10 см3 экстракта табака, 2,5 см3 (0.1 М) гидроксида натрия. Раствор перемешан и доведён до метки (25 см3) водой. Отфильтрованный раствор использовался для определения глюкозы и фруктозы с помощью автоматического биохимического анализатора  Кonelab arena 20xt методом ферментативного анализа.

 

2.3.2 Определение содержания крахмала

 

Определение крахмала основано на вычислении разницы между количеством глюкозы, образующейся в результате гидролиза крахмала и глюкозы, естественным образом присутствующей в образце.

Гидролиз крахмала осуществлён следующим образом: в коническую колбу на 100 см3 помещено 0,3 г табака и прилито 20 см3 диметилсульфооксида (DMSO) и 5 см3 8М соляной кислоты. Колба закрыта  и нагревалась 30 минут при 600C на водяной бане при перемешивании. Затем содержимое колбы было  быстро охлаждено, добавлено 50 см3 дистиллированной воды и рН раствора доведено до значения 4,5 с помощью 5М гидроксида натрия. Раствор перенесен в мерную колбу, доведен до 100 см3, после чего отфильтрован. Отфильтрованный раствор использовался для определения глюкозы с помощью автоматического биохимического анализатора Кonelab arena 20xt методом ферментативного анализа.

 

2.3.3 Определение содержания органических кислот

 

В коническую колбу на 100 мл помещается 1 г  табака и приливается 60 см3 дистиллированной воды. Содержимое колбы перемешивалось в течение 10 минут с помощью магнитной мешалки. Экстракт перенесен в мерную колбу на 100 см3. Объём смеси доведён водой до 100 см3. Экстракт отделён от осадка табака фильтрованием. Профильтрованный экстракт разбавлен дистиллированной водой в 10 раз. Полученный раствор использовался для анализа методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель 105М». Детектирование велось при длине волны 254 нм, U = -20 kB.

 

2.4 ГХ-МС анализ

 

Для проведения ГХ-МС анализа были приготовлены экстракты табака методом ультразвуковой экстракции. Для этого измельченные (фракция помола: 0,5+0,04 мм) навески образцов табака массой 1 г помещены в стеклянные пробирки. К каждой навеске добавлено 10 см3 ацетона. Пробирки помещены в ультразвуковую ванну мощностью 100 Вт и частотой 35 кГц. Длительность ультразвуковой экстракции составила 10 минут. Дополнительный нагрев не применялся. После обработки пробирки были оставлены в горизонтальном положении на 120 минут  для отделения осадка. Надосадочная жидкость была использована для ГХ-МС анализа.

Для получения экстрактов дыма образцы табака массой 1,61 г и 1,97 г  (начальный и конечный образцы,  соответственно) были помещены в уплотнённом состоянии в металлические трубки диаметром 10 мм. Плотность трамбовки составила 0,34 и  0,42  г/см3. Трубки с образцами табака подсоединены к промывающему сосуду, заполненному 10 см3 ацетона. После сборки прибора образцы табака в металлических трубках были подожжены. Тяга прибора создавалась с помощью вакуумного насоса. Ацетон, содержащий ароматические вещества дыма был собран и доведён до объёма 16,1 и 19,7 см3. Таким образом, на 10 см3 ацетона приходилось  1 г  табака. Полученные растворы были использованы для ГХ-МС анализа.

ГХ-МС анализ был проведён на приборе Shimadzu GCMS QP-2010Ultra. Разделение проводилось на колонке SLB-5 MS. Все вещества в пробе были выделены в виде отдельных хроматографических пиков. Полученные масс-спектры индивидуальных веществ были распознаны автоматически с применением базы данных WILLEY 7.0.

 

2.5 Определение содержания неорганических катионов

 

Пробоподготовка заключается во взятии навески измельченного табака массой 150 мг и добавлении 10 см3 соляной кислоты (1:1), после чего пробирку закрывают и проводят кислотный гидролиз в течение 16 часов при температуре 1100С. После гидролиза пробу фильтруют. Далее отбирают аликвоту 0,5 см3 и упаривают под струёй горячего воздуха. Затем  добавляется 0,5 см3 дистиллированной воды и центрифугируется при 6000 об/мин в течение 5 мин. Определение катионов проводилось методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель 105М». Детектирование велось при длине волны 267 нм, U = +25kB.

 

2.6 Определение технологических характеристик табака

 

Изучая химический состав табака в процессе ферментации, прежде всего, необходимо учитывать такие группы технологических показателей как влажность, рН, оптические спектры экстрактов табака.

 

2.6.1 Определение рН

 

Навеска измельченного табака массой 1 г  помещена в колбу на 200 см3 и залита 50 см3 дистиллированной воды (соотношение 1: 50). Суспензия взбалтывалась в течение 5 минут, после чего был измерен рН среды с помощью рН-метра.

 

2.6.2 Изучение оптических спектров экстрактов табака

 

Для экстракции белков использовалась дистиллированная вода и буферные растворы с рН=4.01; 6,86; 10. Процедура экстракции заключалась в следующем: образец табака измельчался до состояния пыли (фракция помола: 0,5±0,04 мм). Навеска измельченного табака массой 1 г  помещалась в пробирку. К полученной навеске добавлялось 9 см3 дистиллированной воды. Масса взбалтывалась и проводилась У/З - экстракция в ультразвуковой ванне мощностью 100 Вт и частотой 35 кГц в течение 30 минут. Далее экстракт центрифугировался при комнатной температуре при скорости 9000 об/мин (угловой ротор) в течение 5 минут. Супернатант разбавлялся в 10, 100 и 1000 раз для снятия оптических спектров.

Оптические спектры экстрактов были получены с помочью прибора Cary 50 Bio (Agilent). Съёмка спектров велась в 1 см - кварцевой кювете с разрешением 1 нм.

 

2.7 Исследование сенсорных характеристик табака

 

Основными показателями качества табачного дыма являлись: аромат, вкус, крепость. Кроме того, табачные изделия оценивали по горючести. На основании опроса большого числа курильщиков, показатели качества табачного дыма по значимости располагаются в следующем порядке: вкус, аромат, крепость, горючесть. Дегустационная оценка табачных изделий производится по 100-балльной системе, при этом, вкус оценивают - 42 баллами; аромат оценивают - 34 баллами; крепость оценивают - 14 баллами; горючесть оценивают - 10 баллами[3].

 

2.7.1 Вкус табачного дыма

 

Вкус табачного дыма - показатель, характеризующий суммарные ощущения, воспринимаемые непосредственно органами вкуса курящего. Показателями вкуса табачного дыма являются: горечь, жжение, раздражение, щипание, обкладка и пустота вкуса.

Полное  отсутствие показателя "горечь" оценивают - 11 баллов; кроме того,  градация  этого показателя  имеет три степени интенсивности: слабая горечь - 8 баллов; средняя горечь - 4 балла;  сильная горечь - 0 баллов.
 

“Жжение” - показатель вкуса, характеризующийся жгучестью, которая локализуется в средней и задней части языка, нёба и горла. Отсутствие показателя "жжение" оценивают в 10 баллов. Дифференциация  показателя имеет три степени интенсивности: слабое жжение - 7 баллов; среднее жжение - 4 балла; сильное жжение - 0 баллов.
 

“Раздражение” - показатель вкуса табачного дыма, обуславливающий степень воздействия табачного дыма на горло курильщика. Отсутствие показателя "раздражение" оценивают - 8 баллов; показатель имеет три степени интенсивности: слабое раздражение - 6 баллов, среднее раздражение - 3 балла; сильное раздражение - 0 баллов.
 

“Щипание” - показатель вкуса, характеризующий щипание слизистых оболочек рта, кончика и средней части языка. Отсутствие показателя "щипание" оценивают - 5 баллов. Показатель "щипание" имеет три степени интенсивности: слабое щипание - 3 балла; среднее щипание - 1 балл; сильное щипание - 0 баллов.
 

“Обкладка”- показатель вкуса, обуславливающий остаточные вкусовые ощущения, воспринимаемые нёбом. Отсутствие показателя "обкладка" оценивают - 5 баллов. Показатель "обкладка" имеет три степени интенсивности: слабая обкладка - 3 балла; средняя обкладка - 1 балл; сильная обкладка - 0 баллов.
 

“Пустота” - ощущение вкусовой ненасыщенности дыма. Отсутствие показателя "пустота" оценивают - 3 балла. Показатель "пустота" имеет три степени интенсивности: незначительная пустота- 2 балла; средняя пустота - 1 балл; сильно выраженная пустота - 0 баллов.
 

Для характеристики образца по вкусу дегустатор определяет наличие и интенсивность всех показателей вкуса. Каждый показатель затем оценивают в баллах, полученные оценки суммируют для получения общей интегральной оценки по вкусу в баллах.

 

2.7.2 Аромат табачного дыма

 

Аромат табачного дыма - показатель, характеризующий специфический запах табачного дыма. Аромат дыма табачных изделий органолептически оценивают по пяти показателям, в зависимости от качества табачного дыма.
 

“Ароматичный с букетом” - аромат табачного дыма, приятный, хорошо сочетающийся с оттенками запаха дыма различных типов использованного табачного сырья. Показатель "ароматичный с букетом" имеет три степени интенсивности: сильный - 34 балла; средний - 32 балла; слабый - 29 баллов.
 

“Ароматичный, приятный“ - аромат табачного дыма приятный, может иметь преобладающий аромат, сочетающийся с ароматом дыма табачного сырья. Показатель "ароматичный, приятный" имеет три степени интенсивности: сильный - 26 баллов; средний - 24 балла; слабый - 21 балл.
 

“Простой” - обычный ординарный табачный аромат, характерный для скелетного сырья         (основа  и наполнитель). Показатель "простой" имеет три степени качества: простой с оттенком приятного - 18 баллов; простой - 16 баллов; простой с оттенком грубости и дефекта - 13 баллов.
 

“Грубый” - тяжелый, резкий, неприятный аромат табачного дыма. Показатель "грубый" имеет три степени дифференциации: слегка грубый - 10 баллов; с наличием средней грубости - 7 баллов; грубый, неприятный - 3 балла.
 

“Дефектный“ - очень грубый аромат, характеризующийся наличием не табачных оттенков. Оценка показателя "дефектный" - 0 баллов.
 

Для характеристики образца табачных изделий по аромату дыма дегустатор определяет один показатель, степень его интенсивности или качества и даёт одну оценку в баллах.

 

2.7.3 Крепость табачного дыма

 

Крепость табачного дыма - показатель, характеризующий способность табачного дыма при его употреблении физиологически воздействовать на организм человека.
 

“Очень лёгкая” - практически не оказывает физиологического воздействия на организм курящего - 14 баллов.
 

“Лёгкая” - оказывает незначительное физиологическое воздействие на организм курящего - 14 баллов.
 

“Средняя” - вызывает достаточное физиологическое воздействие на организм курящего, но не даёт неприятных ощущений - 14 баллов.
 

“Крепкая” - оказывает сильное физиологическое воздействие на организм курящего, вызывает головокружение, сопротивление в горле - 9 баллов.
 

“Очень крепкая” - оказывает очень сильное физиологическое воздействие на организм курящего, вызывает спазм в горле, кашель, сильное головокружение - 3 балла.
 

Для характеристики образца по крепости табачного дыма дегустатор определяет один уровень интенсивности показателя и даёт оценку в баллах.

 

2.7.4 Горючесть табачных изделий

 

Горючесть табачных изделий - показатель, характеризующий способность подожжённого табачного изделия к тлению. Показатель "горючесть" имеет три уровня интенсивности.
 

“Нормальная горючесть” - табачное изделие горит при частоте затяжек не более одной в одну минуту, цвет пепла - светло-серый - 10 баллов.
 

“Слабая горючесть” - сигарета горит при частоте затяжек 2-3 в одну минуту, цвет пепла – тёмно-серый - 5 баллов.
 

“Плохая горючесть“- изделие гаснет в процессе курения, цвет пепла тёмный - 0 баллов.

 

2.7.5 Итоговая дегустационная оценка

 

Итоговая дегустационная оценка образца табачного изделия складывается из: суммарной оценки вкуса  - в баллах; суммарной оценки аромата - в баллах; суммарной оценки крепости - в баллах; суммарной оценки горючести - в баллах.

Полной оценкой качества образца считается среднее арифметическое из данных всех дегустаторов. При расхождении между итоговыми оценками дегустаторов более 10 баллов назначается повторная дегустация. При наличии таких расхождений при повторной дегустации, итоговая оценка дегустатора с отклонениями более 10 баллов исключается при подсчёте полной оценки (средней арифметической).

 

2.8 Применение математических методов анализа данных

 

2.8.1 Корреляционный анализ

 

Для нахождения зависимостей между отдельными величинами были найдены линейные коэффициенты корреляции. Вычисления осуществлялись посредством пакета анализа данных Microsoft Excel.

 

2.8.2 Кластерный анализ

 

Для группировки различных характеристик табака был применён кластерный анализ. Кластерный анализ проводили с помощью программного обеспечения Statistica 10. Объединение характеристик в кластеры было произведено с помощью иерархических методов кластеризации: расстояние «ближайшего соседа», расстояние «дальнего соседа», невзвешенного попарного среднего, взвешенного попарного среднего, невзвешенного центроидного  метода, взвешенного центроидного метода, метода Варда. В качестве меры расстояния между кластерами было выбрано Евклидово расстояние [4,5,6].

 

2.9 Реактивы

 

Чистота всех использованных в работе реактивов была не менее 98%. 

 

3. Результаты и обсуждение

 

3.1 Результаты исследования органических азотосодержащих веществ; углеводов и продуктов их диссимиляции; неорганических катионов; технологических характеристик.

 

В таблице 1 представлены результаты анализа содержания белковых веществ различными методами, аминокислот и никотина; глюкозы, фруктозы, крахмала и органических кислот; неорганических катионов; технологических характеристик в процессе ферментации табака. Данные, представленные в мг/г, приводятся в пересчёте на сухой табак.

 

Таблица 1

 

 

Анализ данных по содержанию азотосодержащих веществ позволяет сделать следующие выводы:

 

  •  Как видно из таблицы в процессе ферментации табака происходит уменьшение содержания белковых веществ. Однако данное уменьшение имеет нелинейный и немонотонный характер: в самом начале процесса происходит сильное снижение содержания белков, однако, на заключительном этапе происходит их увеличение. Данное явление может быть связано с высвобождением и разрушением высокомолекулярных белков, входящих в состав листьев табака, высвобождение и разрушение которых возможно только после глубинного разрушения клеточной структуры листьев;

  • Сильное различие в значениях концентраций, измеренных методами Лоури и Бредфорда, объясняется тем, что метод  Лоури специфичен как для высокомолекулярных белков, так и низкомолекулярных пептидов (реакция основана на образовании комплекса с пептидной связью), тогда как метод  Бредфорда рассчитан на определение высокомолекулярных белков. Таким образом, в экстракте табака, особенно в готовом Кавендише, преобладают, в основном, низкомолекулярные белки. При  этом, интегральное количество белков по Брэдфорду за период ферментации уменьшается в 2,5 раза;

  • Динамика изменения аминокислотного состава табака в процессе ферментации является разнонаправленной, хотя общая тенденция - это уменьшение суммарного содержания всех выделенных аминокислот на 17%. Во время ферментации особенно сильно уменьшается содержание пролина, лизина, треонина. Это, вероятнее всего, связано с ходом и спецификой протекания реакции Майяра, в результате которой часть аминокислот, получаемых в результате разрушения белков, вступают в активную реакцию с сахарами. Данный факт так же  отражается в сильном потемнении табака в процессе ферментации;

  • В результате процесса ферментации наблюдается снижение содержания никотина почти на 15%;

  • В целом, процесс ферментации оказывает сильное влияние на состав азотосодержащих веществ табака. На фоне снижения общего количества белка происходят изменения в аминокислотном составе и содержании никотина. Причём, данные изменения, вероятнее всего, взаимосвязаны с параллельно протекающими процессами изменения других соединений.

 

Анализ данных содержания углеводов и продуктов их диссимиляции позволяет сделать следующие выводы:

 

  • На первоначальном этапе ферментации происходит падение содержания глюкозы, фруктозы и крахмала, однако,  в период 15-20 день происходит незначительный рост концентраций.
     
  • Подобная ситуация схожа с изменением концентрации белковых веществ и,  вероятнее всего, связана с глубинным разрушением клеточной структуры листьев табака в период 15-20 дней. Необходимо отметить, что увеличению концентрации глюкозы на 20 день предшествует увеличение концентрации крахмала, начиная с 15-го дня. Данный факт свидетельствует о том, что часть высвобожденного крахмала может расщепляться до глюкозы на более поздних этапах ферментации табака. Так же необходимо  отметить  общую  тенденцию уменьшения концентрации сахаров, примерно, на 44% к  окончанию  процесса  ферментации;
     
  • В результате процесса ферментации происходит увеличение концентрации таких органических кислот как: винная, лимонная, янтарная, молочная, уксусная. При этом, содержание яблочной кислоты достигает максимума на 10-ый день ферментации и далее снижается. Подобное явление,  вероятнее всего,   связано с окислительной трансформацией растворимых углеводов (глюкозы и фруктозы) за счет ферментативных превращений, входящих в цикл трикарбоновых кислот. Суммарное  увеличение  содержания   органических  кислот  составляет, около  16%. Параллельно  наблюдается  процесс  смещения  водородного  показателя  в  кислую  среду  на 21%  со  значения  5,22 до 4,13 .

 

Анализ данных содержания неорганических катионов позволяет сделать следующие выводы:

 

  • В процессе ферментации происходит уменьшение концентраций неорганических катионов, однако,   данный процесс не является линейным и монотонным. При этом, необходимо отметить локальное повышение концентрации катионов на 10-ый  день ферментации. Подобный процесс, вероятнее всего,  связан с разрушением клеточной структуры листьев табака и высвобождением неорганических катионов в середине процесса ферментации. Потери  аммония, скорее  всего,  связаны c его улетучиванием  в  виде   свободного аммиака -  бурно  в начале,  более плавно - к  окончанию  процесса  ферментации.  Кроме  того,  снижение  содержания  неорганических  катионов объясняется  их  вымыванием   из  клеточной  структуры  за  счёт движения  влаги  в условиях воздействия   градиента  температур  в  процессе  ферментации, а  так  же  их  участием  в  процессе  образования  нагара в  местах  соприкосновения  табака  с  нагревающимися  поверхностями  пресса.  Часть  образующегося  углерода  улетучивается  в процессе  ферментации  в  виде  углекислого  газа.

 

Анализ данных технологических характеристик табака позволяет сделать следующие выводы:

 

  • Уменьшение рН связано с накоплением в листьях табака органических кислот.
     
  • Увеличение оптической плотности экстрактов табака при 260 и 330 нм на 10 день связано с образованием ненасыщенных органических веществ, имеющих хорошее поглощение в УФ области,  в  том  числе, тёмноокрашенных  продуктов  реакции Майяра.

 

3.2  ГХ-МС анализ

 

На рисунке 1 представлена хроматограмма образцов экстрактов (1) табака “до” (a) - и “после” (b) ферментации, а также представлена хроматограмма «прокуренных» (2) образцов экстрактов табака, соответственно, “до” (a) - и “после” (b)  ферментации.

 

Рисунок 1

 

 

В таблице 2 представлены основные отличия в составе экстрактов в процессе ферментации в пересчёте на сухой табак. Значения представлены в виде площади хроматографических пиков.

 

Таблица 2

Оценка разнообразия веществ, обнаруженных в образцах экстрактов «прокуренных» табаков “до” - и “после”   ферментации, позволяет констатировать, что:
 

  • количество  идентифицированных  веществ до ферментации составляет  51 вещество;
     
  • количество идентифицированныхвеществ после ферментации составляет 87 веществ;
     
  • количество веществ,  не изменившихся в процессе ферментации, составило 34 вещества;
     
  • количество веществ, исчезнувших в процессе ферментации, составило 17 веществ;
     
  • количество веществ, появившихся в процессе ферментации, составило 53 вещества.
     

Анализ ГХ-МС данных экстрактов табака позволяет сделать вывод, что в процессе ферментации табака изменяется содержание производных длинноцепочечных углеводородов (неофитадиена, гексадекановой кислоты и др.).  Для остальных органических соединений наблюдается разнонаправленная немонотонная динамика. Общее разнообразие летучих органических веществ в экстракте при этом изменяется незначительно.


Анализ ГХ-МС данных дыма позволяет сделать вывод, что ферментация табака приводит к образованию большого количества летучих органических соединений в табачном дыме. Необходимо отметить, что большое разнообразие новых летучих органических веществ наблюдается именно в табачном дыме, а не в экстрактах, что,  вероятнее всего,  связано с образованием этих веществ  преимущественно на этапе пиролиза в процессе курения. При этом прекурсорами для летучих веществ могут быть нелетучие вещества, получаемые в процессе ферментации.

 

3.3 Исследование сенсорных характеристик табака

 

В таблице 3 представлены данные комплексной органолептической оценки табака в процессе ферментации.

 

Таблица 3

Анализ данных таблицы 3 позволяет сделать вывод об интегральном  улучшении - на  17% сенсорных характеристик дыма табака,  которое  происходит на заключительном этапе ферментации. Улучшение  заключается  в  уменьшении  крепости  дыма (10%)  на  фоне  смягчения  ощущений  жжения (50%),  горечи (12%)  и раздражения  ротовой  полости (33%) при курении. Кроме того,  ароматичные   свойства  дыма  улучшаются  на  35%.

 

3.4 Применение математических методов анализа данных

 

3.4.1 Корреляционный анализ

 

На рисунке 2 представлены результаты кластерного анализа для исследуемых величин.
 

Рисунок 2

 

На рисунке 2 отмечены коэффициенты корреляции, превышающие значения ‘’+’’ 0,8 и характеризующие сильную положительную корреляцию между характеристиками,  а  также отмечены коэффициенты корреляции менее “-“ 0,8, соответственно, характеризующие сильную отрицательную корреляцию между характеристиками. Кроме того, выделены коэффициенты корреляции, связанные с сенсорными характеристиками восприятия дыма  табака.

Из рисунка 2 видно, что некоторые характеристики сильно коррелируют (положительно и отрицательно) со многими другими характеристиками. Так, например,  содержание молочной кислоты сильно коррелирует с  такими характеристиками как: содержание серина, никотина, фруктозы, Neophytadiene и Hexadecanoic acid. Для группировки взаимосвязанных  высокой  корреляцией  характеристик был использован метод кластерного анализа.

 

3.4.2 Кластерный анализ

 

Дендрограммы, полученные при объединении характеристик в кластеры методами расстояние «дальнего соседа», невзвешенного попарного среднего, взвешенного попарного среднего, метода Варда имеют сильное сходство друг с другом. В качестве примера на рисунке 3 представлена дендрограмма, полученная методом Варда.

 

Рисунок 3 

 

Анализ данных корреляционного и кластерного анализа позволяет сделать следующие выводы:

 

1. Органолептика табака тесно связана с содержанием органических кислот (лимонной, уксусной, янтарной) по коэффициентам корреляции и по древам кластерного анализа. Скорее всего, данный  факт связан с реакцией этерификации,  происходящей   между  кислотами  и  компонентами   соуса, с  соответствующим  переходом образовавшихся   сложных  эфиров  в дым   во  время  пиролиза  табака при курении.  Кроме  того,  в  дым так же  переходят  продукты  реакции  Майяра.
 

2. Существует отрицательная корреляция между сахарами и кислотами, т.е. кислоты могут получаться из сахаров путем реакций из цикла трикарбоновых кислот.
 

3. Винная, янтарная и уксусная кислота растут или убывают синхронно (положительная корреляция), -  в теории они могут взаимопревращаться друг в друга или получаться из сахаров (п.2)
 

4. Белки оказывают слабое влияние на органолептику (коэффициенты корреляции меньше 0,8 по модулю), тем не менее, корреляция отрицательная, т.е. снижение содержания белка может быть косвенно связано с улучшением органолептики табака. Этот  тезис косвенно  подтверждается  результатами органолептики, -  такие  характерные для белковых компонент дыма идентификаторы как ‘’раздражение’’ и ’’горечь’’  с  соответствующими  коэффициентами позитивных  изменений  33% и 12%, улучшают вкус дыма вместе с остальными идентификаторами только  на  14%,  в то время как ароматичные  свойства  дыма  улучшаются  на  35%.
 

5. Аммоний выступает антиподом органических кислот, т.е. его повышение подщелачивает среду.
 

6. Сахара и белки диссимилируются в рамках одного процесса однонаправленно.
 

7. рН однонаправленно снижается со снижением концентрации сахаров и белков, что, скорее всего, связано с образованием из них органических кислот.

 

 

Заключение

 

 

Процесс ферментации табака является сложным процессом. В результате проведенного исследования стало очевидно, что в процессе ферментации могут протекать одновременно несколько взаимовлияющих процессов. Среди таких процессов можно выделить:  деструкция белков,  деструкция полисахаридов, реакции между низкомолекулярными соединениями и их взаимопревращения. Важно отметить, что воздействие на один из процессов высокого ранга может косвенно оказать влияние на процесс более низкого ранга, например, добавление к листьям табака глюкозо-фруктозного сиропа приводит к образованию органических кислот, что в свою очередь,  оказывает положительное влияние на сенсорные характеристики табака при его курении.  Тем  не  менее,  необходимо  отметить, что  улучшение   сенсорных  характеристик  табака  обусловлено  не  только  существенными  изменениями  его  химической  структуры,  но  так  же и  тем,  что  существенные  изменения  в структуре  белков,  углеводов,  кислот  сами  по  себе  являются  ещё  и  существенными  инициаторами  новых  химических  реакций,  которые  инициируются  во  время  пиролиза  табака.  Идентификация  в  ходе  данной  работы  большого  количества  новых   химических  соединений  свидетельствует  об этом  факте  достаточно  однозначно.  C точки зрения индустриального  применения  результатов  данного  исследования необходимо  отметить  следующее:

- дополнительная  тепловая  обработка  табака в  глюкозо-фруктозном  сиропе  позволяет  существенно  улучшить  вкус  дыма  за счет  снижения  содержания  азотных компонент,  никотина и  существенного  улучшения  аромата  дыма.  Данный факт  позволяет  индустрии  использовать тепловую  обработку  как  для  улучшения  сенсорных  свойств  дыма для  серийно  используемого  сырья,  так и  для  переработки   приобретённого  табачного  сырья  с  ярко  выраженными  дефектами  вкусо-ароматического   профиля;

- изменение  температурных  режимов  и концентрации  соуса  для обработки   табака  перед  ферментацией  в  части  соотношения  глюкозы,  фруктозы, высокоатомного   спирта  в  сочетании  со  спецификой  содержания   органических  кислот  в  табачном  сырье  может  давать  различные  результаты  по  аромату  собственно  ферментированного  табака  и  продуктам  его  пиролиза.  Таким образом,  тепловую ферментацию  в  средах  можно  использовать  для  создания  уникального  вкусо-ароматического  профиля;

- поскольку  в  результате   тепловой  ферментации   происходят   глубокие  изменения  в  химической  структуре  табака  на  уровне  внутриклеточных   изменений,  то, с  точки  зрения  изменений  вкусо-ароматического  профиля, -  данные   изменения  можно  считать   в некоторой   степени   “капсулированным  ароматом”,   который, -  в  отличие  от используемой  современной  табачной индустрией поверхностной  ароматизации  бленда,  будет  постепенно  раскрываться  для  курильщика  во  время  курительной  сессии  по  мере  движения  тлеющего  очага  при  затяжке.

 

 

Литература:
 

1. http://pccf.ru/otabake/differencirovannyy-analiz-izmeneniy-v-strukturah-uglevodnogo-i-kislotnogo-kompleksov-tabachnogo
 

2.Уилсон К., Уолкер Дж. "Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии". Пер. с англ. - БИНОМ. Лаборатория знаний , 2013, 849 с.
 

3. Писклов В.П. Дегустационная оценка курительных свойств сигарет по 100-бальной системе / В.П. Писклов, Н.А. Дурунча, И.М. Остапченко – Деп. в Б.Д. «Агрос» НТЦ Информрегистр 2010 02.09. №0220510769
 

4. Буреева Н.Н. Многомерный статистический анализ с использованием ППП “STATISTICA”. Учебно-методический материал по программе повышения квалификации «Применение программных средств в научных исследованиях и преподавании математики и механики». Нижний Новгород, 2007, 112 с.;
 

5. Дэвис Дж. С. Статистической анализ данных в геологии: Пер. с англ. В 2 кн./Пер. В.А. Голубевой; Под.ред. Д.А. Родионова. Кн. 1. – М.: Недра, 1990. – 319 с.: ил. ISBN 5-247-02122-3;
 

6. В.П. Боровиков. Популярное введение в программу STATISTICA